免疫熒光實驗的注意事項：對熒光標記的抗體的稀釋，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋度不應超過1：20，抗體濃度過低，會導致產生的熒光過弱，影響結果的觀察。染色的溫度和時間需要根據各種不同的標本及抗原而變化，染色時間可以從10min到數小時，一般30min已足夠。染色溫度多采用室溫（25℃左右），高于37℃可加強染色效果，但對不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2℃的低溫，延長染色時間。低溫染色過夜較37℃30min效果好的多。免疫熒光技術中，以熒光物質標記抗體來定位抗原物質的方法被稱為熒光抗體技術。CK14免疫熒光檢查

基于熒光成像的技術對于查詢細胞和組織的結構和功能方面非常有用。當與免疫化學結合時，熒光成像技術的分析能力增加，增強了這種技術在普遍的研究和臨床應用中的實用性，使其成為寶貴的工具。免疫熒光顯微鏡通過使活細胞成像能夠可視化整個細胞器，徹底改變了細胞生物學領域。免疫組織化學和免疫細胞化學是結合抗原抗體結合能力進行細胞分析的常用熒光成像技術。免疫熒光（IF）是一種強大的免疫染色技術，利用顯微鏡觀察與靶蛋白和其他目標分子結合的熒光素標記抗體。免疫熒光用于鑒定細胞中的細胞和組織特異性抗原；可視化蛋白質的存在與否、細胞定位和活化狀態；并分析免疫反應。JNK免疫組化IHC免疫熒光技術可以用于研究細胞內分子的相互作用。

免疫熒光的制作：樣品準備（貼壁細胞、懸浮細胞以及組織等）：對于貼壁細胞：先將潔凈的蓋玻片在70%乙醇中進行浸泡處理，然后用干凈無菌的鑷子放置到培養皿中，用無菌PBS洗去殘留的乙醇。待細胞接近長成單層后取出蓋玻片，操作小心，防止細胞脫片。對于懸浮細胞：有2種方法，①先在懸浮液中進行固定步驟，然后把細胞滴加在載玻片上，干燥后細胞會緊貼在載玻片上。②先在懸浮液中進行固定和染色步驟，離心洗脫，然后用移液管移至盒式玻片進行后續染色步驟。對于冷凍切片：切片放置在載玻片上后，可以直接進行固定等后續操作。對于石蠟切片：免疫熒光中石蠟切片較少，要先進行脫蠟和抗原修復處理。

細胞爬片的免疫熒光步驟基本一致：1. 取出細胞爬片放到35mm或60mm用過的細胞培養皿里，PBS洗三遍。注意：有的時候作的細胞爬片可能比較小，因此夾取的時候要小心，注意 反正面，放在皿里洗比較方便，避免了來回夾取，另外洗的時候加PBS不要太沖，不要細胞沖下來。洗的時候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，沒有等5分鐘或10分鐘。2. 4%冷的多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗三遍。3. 0.2%Triton X-100通透10分鐘，PBS洗三遍。4. 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘，PBS洗三遍。5. 一抗4度濕盒內過夜，也可37度2小時，感覺前者效果好，PBS洗三遍。6. 二抗室溫2小時(避光)，或者37度1半小時，PBS洗三遍。7. 較好用DAPI染核，然后直接照熒光片。8. 蒸餾水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因為甘油不象樹脂那樣會干，所以不用指甲油封的話會弄的一塌糊涂。熒光抗體技術具有高靈敏度和高特異性，可以實現精確的免疫檢測。

免疫熒光檢測相對于酶檢測的優勢：定量熒光信號的能力（與使用基于酶的方法進行的定性測定相反）；復用能力（可以結合不同發射光譜的熒光染料來檢測多種蛋白質）；熒光染料的光穩定性。免疫熒光技術是根據抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細胞內的相應抗原（或抗體）。在組織或細胞內形成的抗原抗體復合物上含有標記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受外來激發光的照射而發生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色），可以看見熒光所在的組織細胞，從而確定抗原或抗體的性質、定位，以及利用定量技術測定含量。免疫熒光技術可以通過熒光顯微鏡觀察樣品中的熒光信號，從而確定目標分子的存在和位置。JNK免疫組化IHC

免疫熒光技術可以用于研究細胞遷移和細胞黏附。CK14免疫熒光檢查

熒光的產生：一此化學物質能從外界吸收并儲存能量（如光能、化學能等）而進入激發態，當其從激發態再回復到基態時，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發光）。熒光發射的特點是：可產生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發光；而一旦停止供能，發光（熒光）現象也隨之在瞬間內消失。可以引起發熒光的能量種類很多，由光激發所引起的熒光稱為致熒光。由化學應所引起的稱為化學熒光，由X線或陰極射線引起的分別稱為X線熒光或陰極射線熒光。熒光免疫技術一般應用致熒光物質進行標記。CK14免疫熒光檢查

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