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CD11B免疫熒光IF

來源: 發布時間:2023-09-09

細胞免疫熒光實驗注意事項:根據所檢測抗原所在位置來確認是否需要加入 Triton 進行通透。若所檢測抗原表位位于膜蛋白的白外段,則不需要通透;一般 5% BSA 封閉即可達到效果;從加熒光二抗起,后面所有操作步驟盡量避光。縮短在熒光顯微鏡下的觀察時間,1~2 h 為宜。染色后盡快熒光顯微鏡下觀察,若不能可放入 4 ℃ 冰箱避光保存一周。無/弱染色:烤片溫度過高,推薦 56~60 ℃ 1~2 h;一抗是否適用固定液和石蠟切片,使用濃度是否過低,孵育是否時間過短等。免疫熒光技術利用熒光染料標記的抗體與目標分子結合,從而實現可視化檢測。CD11B免疫熒光IF

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免疫熒光通透(目的是使抗體進入胞內),0.5%TritonX-100(一種去垢劑,用PBS配制)室溫通透20min(針對胞內抗原,若是細胞膜上表達的抗原則省略該步驟);除了TritonX-100,也可作為通透劑,并且固定后的樣品不需要通透。封閉(減少一抗和二抗與非特異位點進行結合),通透后用PBS浸洗玻片3次,每次3min,吸水紙吸干PBS,在玻片上滴加山羊血清,室溫封閉30min。常用的封閉液包括:與二抗同一來源的血清、BSA或者是羊血清。從封閉開始所有的步驟,一定要注意樣品的保濕,避免樣品的干燥,否則極易產生較高的背景。醛類固定的樣品,在用一抗孵育前用含0.3M甘氨酸的封閉液進行封閉。P-AKT 1/2/3免疫熒光檢查免疫熒光技術可以用于研究動物模型和藥物篩選。

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細胞免疫熒光實驗常見問題:1、信號弱或者無信號:細胞或組織樣本保存時間過長;2)抗體濃度不合適,參照抗體說明書的稀釋濃度,再根據樣本表達量進行摸索;3)一抗孵育時間不合適,建議 4 ℃ 過夜孵育。2、高背景:封閉不充分;抗體濃度過高;抗體孵育時間過長或溫度過高;清洗不充分;樣本變干,染色過程確保樣品始終浸沒于液體環境中.3、非特異性染色較多:固定液殘留,這里需要縮短固定時間并且在封閉液中加甘氨酸,并且抗原修復也可以幫助解決非特異性染色;二抗殘留,二抗需要用帶有吐溫 20 的 PBS 溶解,只要熒光顯微鏡的強度還可以增大,那么就可以增加吐溫洗脫掉非特異性染色。

細胞免疫熒光實驗注意事項:非特異性染色:是否滅活內源性過氧化物酶;孵育過程中干片;抗原熱修復過度。染色過深:一抗濃度過高;染色試濃度過高或孵育時間過長;染色劑濃度過高或孵育時間過長。通常實驗室先固定細胞再進行通透,但若檢測抗原是水不溶性蛋白,可先通透再固定,這樣可以通過通透去除一些水溶性蛋白,進而可降低免疫熒光背景和非特異性信號;建議設陰性對照組,消除由于抗體非特異性結合而產生的背景染色;選擇醛類固定液時,保持其新鮮度,較好現配現用,使用不新鮮的醛類固定液自發熒光背景會升高。熒光抗體技術可用于檢測和定位各種抗原,也可以用于檢測和定位抗體。

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熒光色素:異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)為黃色或橙黃色結晶粉末,易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4,較大吸收光波長為490495nm,較大發射光波長520530nm,呈現明亮的黃綠色熒光,結構式如下:有兩種同分異結構,其中異構體Ⅰ型在效率、穩定性、與蛋白質結合能力等方面都更好,在冷暗干燥處可保存多年,是應用較普遍的熒光素。其主要優點是:①人眼對黃綠色較為敏感,②通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。四乙基羅丹明(rhodamine,RIB200)為橘紅色粉末,不溶于水,易溶于酒精。性質穩定,可長期保存。結構式如下:較大吸收光波長為570nm,較大發射光波長為595~600nm,呈橘紅色熒光。免疫熒光技術可以用于研究細胞內蛋白質的定位和表達水平。SERPINF1免疫熒光IF

免疫熒光是一種常用的生物學實驗技術,用于檢測和定位特定抗原或抗體。CD11B免疫熒光IF

免疫熒光的原理:免疫學的基本反應是抗原-抗體反應。由于抗原抗體反應具有高度的特異性,所以當抗原抗體發生反應時,只要知道其中的一個因素,就可以查出另一個因素。免疫熒光技術就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體(或抗原)上,與其相應的抗原(或抗體)結合后,在熒光顯微鏡下呈現一種特異性熒光反應。直接法:將標記的特異性熒光抗體,直接加在抗原標本上,經一定的溫度和時間的染色,用水洗去未參加反應的多余熒光抗體,室溫下干燥后封片、鏡檢。CD11B免疫熒光IF

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