過標記——計算結果顯示每摩爾145,000MW的蛋白標記的熒光團大于10mol。雖然過標記的蛋白也可以使用，但可能會引起蛋白的聚集、降低抗體結合抗原的特異性，這些都會造成非特異性結合。過標記還會引起熒光淬滅。可以增加蛋白或減少反應時間。3．未結合染料難以去除——盡管大部分時候用分離柱可以較好的純化蛋白偶聯物，但仍可能會有痕量的游離染料留在偶聯物溶液中，會使標記計算的值偏高。可用分離柱再次分離或透析去除。4．蛋白或蛋白偶聯物無法洗脫——不要再加緩沖液，只需再次離心一次或幾次。DiD、DiR、DiO和DiI染料是最常見的細胞膜染料，它們是一族親脂性的熒光染料，用于細胞的形態學和結構研究。免疫組化熒光染料Fluor 750
二、***成像分析：D-熒光素，鉀鹽，D-PBS,不含鈣、鎂1、配制溶液使用無菌D-PBS（w/oCa2+;Mg2+）配制D-熒光素鉀鹽溶液（15mg/ml），0.22μm濾膜過濾除菌（避光），分裝后于-20℃或-80℃冷凍保存，避免反復凍融。使用時4℃融化，實驗前平衡至室溫（避光）2、注射量取決于注射方式，具體如下：注射方式劑量靜脈注射（25-27gauge針頭）按10μl/g體重濃度，加入相應體積的15mg/ml熒光素工作液腹腔注射（25-27gauge針頭）按10μl/g體重濃度，加入相應體積的15mg/ml熒光素工作液肌肉注射（27gauge針頭）50μl，濃度為1-2mg/ml熒光素工作液鼻內注射（pipette）50μl，濃度為3mg/ml熒光素工作液3、注射入體內10-20min（待光信號達到**強穩定平臺期），再進行成像分析細胞膜熒光染料納米Super Fluor 750（效果同Alexa Fluor 750）熒光染料。
小動物***成像技術（invivoimagingtechnology）是利用高靈敏度的光學檢測儀器直接檢測動物***體內的細胞活動和基因行為研究的一類技術，是近年來發展**快的生命科學研究方法，是**直接觀察細胞和分子在體內行為的新興技術，已廣泛應用于生命科學研究的各個領域[1]。***動物體內光學成像主要采用生物發光與熒光發光兩種技術。生物發光是利用熒光素酶報告基因在***內表達產生的熒光蛋白與體外注射的熒光素底物發生化學反映產生熒光。而熒光發光成像技術是將熒光物質或熒光物質標記的小分子物質如基因、細胞也可是小分子藥物、抗體、納米材料等導入到***體內，通過小動物***成像系統的激發光源激發熒光集團到達高能量狀態，而后產生波長較激發光長的發射光，然后通過高靈敏度制冷CCD鏡頭探測到***內的發射光。通過***成像技術可以觀測***動物體內**的生長和轉移、炎癥的發生、特定基因的表達和藥物作用效果等生物學過程。
細胞培養后，需要對其生長情況、形態甚至生物學性狀進行觀察。由于細胞小而復雜，若不借助適當的手段，難以觀察其形態、結構，更難發現細胞內各種組分的分子組成及功能。目前，已有多種研究細胞的技術，從光學顯微鏡到電子顯微鏡，從一般細胞化學法到免疫化學法。細胞染色是研究細胞生物學特征的一種常用手段，然而，對于細胞實驗新手來說，想要獲得一張漂亮的細胞染色圖并不容易。染色試劑不會選、細胞染色不均勻、染色時切片脫落等都是很常見的問題。
細胞膜常用染料DiD、DiR、DiO和DiI染料是最常見的細胞膜染料（見表2），它們是一族親脂性的熒光染料，用于細胞的形態學和結構研究。該系列染料進入細胞膜后，會在整個細胞膜上側向擴散，在比較好濃度時可以使整個細胞膜染色。其中DiD染料的染色效率高，染色均一，熒光不易猝滅，無明顯細胞毒性，且受自身熒光背景干擾小。目前DiD已成功應用于多種細胞的體內示蹤研究，如Treg細胞、間充質干細胞、腫瘤細胞、造血干祖細胞等。 SUPER Green I核酸染料特點 。
5(6)-FITC(Fluorescein5(6)-isothiocyanate)是一種胺活性衍生物的熒光染料，具有廣泛的應用，作為抗體和其他探針標記，用熒光顯微鏡，流式細胞儀、免疫熒光方法如ELISA和Western印跡實驗。熒光素衍生物具有高吸收率、優異的熒光量子產率和良好的水溶性，是流式細胞儀和免疫熒光中生物檢測**常用的熒光標記之一。**常用的熒光素包括用于標記蛋白質（特別是抗體）的異硫氰酸熒光素[5(6)-FITC)]，5-FITC和用于標記肽和寡核苷酸的羧基熒光素（5-FAM和5(6)-FAM）。BIOFOUNT提供***的基于熒光素的染料、底物和偶聯物，以及一系列具有針對細胞標記和檢測優化的特性的質量iFluor?熒光標記染料。目前常用標記蛋白/抗體的熒光素主要有BODIPY類、香豆素類、羅丹明類、近紅外類、NBD胺類以及菁染料等。免疫組化熒光染料Fluor 750
南京星葉生物熒光染料標記蛋白。免疫組化熒光染料Fluor 750
納米粒子納米顆粒是指尺寸在1到100納米之間的顆粒。由于它們的小尺寸，納米粒子通常用于不同類型的細胞和組織的熒光成像。當今生物成像中常用的一些納米材料包括碳點、貴金屬納米顆粒、聚合物點、量子點和熒光摻雜二氧化硅等。在成像中，與其他分子熒光團和探針相比，納米顆粒/納米材料具有多種優勢，使其成為理想的選擇。除了提高亮度外，納米粒子是惰性的并且往往分布均勻，這有助于在成像過程中獲得更好的結果。此外，與各種分子熒光團相比，納米顆粒和納米材料沒有細胞毒性，并且不受非特異性結合問題的影響。由于這些特性，大多數熒光納米顆粒（染色納米顆粒）可以內化到細胞/組織中，并容易靶向給定部位。免疫組化熒光染料Fluor 750