表觀遺傳學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)了特定基因區(qū)域的DNA甲基化修飾對于染色體構(gòu)象、基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制有著重要影響，而全基因組DNA甲基化研究將是表觀基因組學(xué)為關(guān)注的內(nèi)容之一。Bisulfite處理能夠?qū)⒒蚪M中未發(fā)生甲基化的C堿基轉(zhuǎn)換成U，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后變成T，與原本具有甲基化修飾的C堿基區(qū)分開來，再結(jié)合高通量測序技術(shù)，可繪制單堿基分辨率的全基因組DNA甲基化圖譜。特定物種的高精確度甲基化修飾模式的分析，必將在表觀基因組學(xué)研究中具有里程碑式的意義，并且為細(xì)胞分化、組織發(fā)育等基礎(chǔ)機(jī)制研究，以及動植物育種、人類健康與疾病研究奠定基礎(chǔ)。WGBS的流程與全基因組DNA測序主要區(qū)別于DNA文庫的構(gòu)建。上海亞硫酸鹽甲基化重測序怎么解決

DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾，它是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyl-transferase, DNMT）催化S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)作為甲基供體，將胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶（mC）的一種反應(yīng)，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是存在的化學(xué)性修飾堿基。CG二核苷酸是**主要的甲基化位點(diǎn)，它在基因組中呈不均勻分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的區(qū)域，在哺乳動物中mC約占C總量的2－7％。甲基化檢測服務(wù)-亞硫酸氫鈉處理后測序法 (bisulfite genomic sequencing PCR, BSP)是利用未甲基化的胞嘧啶可以被亞硫酸氫鈉發(fā)生脫氨基變?yōu)槟蜞奏さ脑恚脙梢惶禺愋砸飻U(kuò)增后測序。測序法克服了只能針對單個位點(diǎn)檢測，并且這些位點(diǎn)必須是限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的缺點(diǎn)，可以對任何基因序列的甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測。天津CPG島甲基化重測序DNA甲基化是基因組DNA的一種主要表觀遺傳修飾形式。

DNA甲基化主要形成5－甲基胞嘧啶（5-mC）和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7－甲基鳥嘌呤（7-mG）結(jié)構(gòu)基因含有很多CpG 結(jié)構(gòu), 2CpG 和2GPC 中兩個胞嘧啶的5 位碳原子通常被甲基化, 且兩個甲基集團(tuán)在DNA 雙鏈大溝中呈特定三維結(jié)構(gòu)。基因組中60%～ 90% 的CpG 都被甲基化, 未甲基化的CpG 成簇地組成CpG 島,位于結(jié)構(gòu)基因啟動子的core序列和轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。有實(shí)驗(yàn)證明超甲基化阻遏轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行。DNA 甲基化可引起基因組中相應(yīng)區(qū)域染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化, 使DNA 失去核酶?限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn), 以及DNA 酶的敏感位點(diǎn), 使染色質(zhì)高度螺旋化, 凝縮成團(tuán), 失去轉(zhuǎn)錄活性。5 位C 甲基化的胞嘧啶脫氨基生成胸腺嘧啶, 由此可能導(dǎo)致基因置換突變, 發(fā)生堿基錯配: T2G, 如果在細(xì)胞分裂過程中不被糾正,就會誘發(fā)遺傳病或cancer, 而且, 生物體甲基化的方式是穩(wěn)定的, 可遺傳的。

DNA甲基化即在DNA上增加甲基基團(tuán)，是使基因的轉(zhuǎn)錄抑制或沉默的主要方式。該修飾特異性地發(fā)生在CpG位點(diǎn)，胞嘧啶通過磷酸鹽與鳥苷酸連接(圖1)。甲基基團(tuán)的插入改變了DNA的表觀和結(jié)構(gòu)，可能會直接阻礙DNA的識別及與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，或者吸引其他因子優(yōu)先與DNA結(jié)合，干擾轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。目前已鑒定了三個與甲基化DNA結(jié)合的蛋白家族，包括MBD蛋白、Kaiso和Kaiso樣蛋白、以及SRA蛋白。通過招募這些蛋白，DNA甲基化可促進(jìn)某些組蛋白狀態(tài)的維持，如去乙酰作用，從而保持轉(zhuǎn)錄后的組蛋白修飾。例如，MBD家族的甲基CpG結(jié)合蛋白2(MeCP2)與甲基CpG結(jié)合，招募HDACs，可促使染色體濃縮和轉(zhuǎn)錄抑制。亞硫酸氫鹽處理是一種分類5-甲基胞嘧啶和非甲基化堿基的有效方法之一。

DNA甲基化是表觀遺傳調(diào)控的常見機(jī)制。啟動子區(qū)域的高度甲基化可導(dǎo)致基因表達(dá)改變。甲基化多發(fā)生于胞嘧啶（cytosine, C）位置。在細(xì)胞和組織分化、疾病發(fā)生以及適應(yīng)環(huán)境等過程中，甲基化狀態(tài)可發(fā)生改變。高精確度全基因組甲基化修飾狀態(tài)的分析，將為發(fā)育、育種、tumour標(biāo)志物鑒定或藥物靶標(biāo)尋找等研究奠定基礎(chǔ)。全基因組甲基化測序結(jié)合了亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化（bisulfite conversion）方法與新一代高通量測序技術(shù)，可在單堿基分辨率水平上高效地檢測全基因組DNA甲基化狀態(tài)。亞硫酸氫鹽處理可以使DNA中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變，PCR擴(kuò)增所需片段，則尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序，與參考序列比對，即可判斷CpG/CHG/CHH位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化。DNA甲基化測序可在全基因組水平上比較大限度的、完整的獲取甲基化狀態(tài)信息和與基因表達(dá)調(diào)控的多重關(guān)系.北京多重PCR技術(shù)甲基化重測序報告

常規(guī)全基因組甲基化測序技術(shù)通過T4-DNA連接酶，在超聲波打斷基因組DNA*段的兩端連接接頭序列。上海亞硫酸鹽甲基化重測序怎么解決

Hi-Methylseq結(jié)合了亞硫酸鹽轉(zhuǎn)換、靶向擴(kuò)增子高通量測序技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)多區(qū)段、多位點(diǎn)的甲基化精確定量分析，適用于感興趣的目的片段的甲基化研究和在大樣本中進(jìn)一步確認(rèn)全基因組甲基化研究挑選的陽性位點(diǎn)。采用翼和自主知識產(chǎn)權(quán)的多重PCR捕獲技術(shù)，確保目的片段有效富集，經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后，DNA序列復(fù)雜度嚴(yán)重降低，嚴(yán)格控制建庫PCR的循環(huán)數(shù)，降低非特異性擴(kuò)增，通過將參考序列中的C堿基全部替換為T堿基，然后將測序reads比對到轉(zhuǎn)換后的參考序列上，針對每一個CpG位點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)C和T堿基的讀數(shù)（類似于SNP calling），來判斷該位點(diǎn)的甲基化。上海亞硫酸鹽甲基化重測序怎么解決

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