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來源: 發(fā)布時間:2022-06-18

細胞轉染那些事兒:1.選擇傳代次數較低并處于對數生長期的細胞進行轉染。對大多數細胞而言,均需要在轉染當天或前現在鋪板,第二天上午進行轉染,48h后收集細胞進行功能檢測。對于原代細胞,可用促有絲分裂刺激物進行細胞活化。2.對于貼壁細胞,一般要求在轉染前一日,用胰酶處理為單細胞懸液,重新接種于培養(yǎng)皿或瓶,較好在轉染前4小時換一次新鮮培養(yǎng)液。3.支原體污染會嚴重降低細胞轉染的效率,且支原體不會像細菌污染那么明顯,因而轉染前可用環(huán)丙沙星處理細胞以除去支原體。對于貼壁細胞,一般要求在轉染前一日,用胰酶處理為單細胞懸液。珠海細胞高效轉染試劑直銷價

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細胞轉染常用步驟:1.轉染試劑的準備①將400ul去核酸酶水加入管中,震蕩10秒鐘,溶解脂狀物。②震蕩后將試劑放在-20攝氏度保存,使用前還需震蕩。2.選擇合適的混合比例(1:1-1:2/脂質體體積:DNA質量)來轉染細胞。在一個轉染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質量的MyoD或者EGFP的DNA,震蕩后在加入合適體積的轉染試劑,再次震蕩。3.將混合液在室溫放置10―15分鐘。4.吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基,用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。5.加入混合液,將細胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時。6.到時后,根據細胞種類決定是否移除混合液,之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時~武漢正規(guī)細胞高效轉染試劑哪家好轉染試劑的準備①將400ul去核酸酶水加入管中,震蕩10秒鐘,溶解脂狀物。

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細胞轉染的常用方法:細菌轉染:原理:對于用脂質體不能實現轉染的細胞,可以采用細菌轉染??捎糜诘鞍踪|過表達或克制,是臨床研究中較常用的方法。它通過侵染宿主細胞將外源基因整合到染色體中,可用于難轉染細胞、原代細胞的穩(wěn)定性轉染。實驗步驟:通過基因克隆生成重組細菌→采用非細菌法轉染包裝細胞系,擴增并分離得到重組細菌顆?!兓⒌味毦骸D導目的細胞(含有細菌特異性的受體)→去除培養(yǎng)物中的細菌,并加入新鮮培養(yǎng)基→分析細胞瞬時基因表達或沉默情況。

大多數已建立的細胞系都是非整倍體,原代培養(yǎng)包括了表達不同基因組合的細胞的混合物。細胞培養(yǎng)在實驗室中保存數月和數年后會經歷突變,總染色體重組或基因調控變化等而演化,這會導致和轉染相關的細胞行為的變化。如果隨時間發(fā)現這種變化,融化一管新鮮的細胞可能會恢復原先的轉染活性。比如,新鮮融化的NIH3T3細胞比傳代8次的細胞表現出更高的轉染效率,融化細胞的進一步傳代并沒有降低轉染效率。因此,如果觀察到轉染效率降低,可以試著轉染新鮮培養(yǎng)的細胞以恢復較佳結果。操作簡便,對細胞毒性小,轉染效率高受到研究者們的青睞。

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轉染的注意事項:培養(yǎng)基中的物品物品,比如青霉素和鏈霉素,是影響轉染的培養(yǎng)基添加物。這些物品一般對于真核細胞無毒,但陽離子脂質體試劑增加了細胞的通透性,使物品可以進入細胞。這降低了細胞的活性,導致轉染效率低。所以,在轉染培養(yǎng)基中不能使用物品,甚至在準備轉染前進行細胞鋪板時也要避免使用物品。這樣,在轉染前也不必潤洗細胞。對于穩(wěn)定轉染,不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素,因為這些物品是GENETICIN選擇性物品的競爭性克制劑。另外,為了保證無血清培養(yǎng)基中細胞的健康生長,使用比含血清培養(yǎng)基更少的物品量。大多數已建立的細胞系都是非整倍體,原代培養(yǎng)包括了表達不同基因組合的細胞的混合物。細胞培養(yǎng)在實驗室中保存數月和數年后會經歷突變,總染色體重組或基因調控變化等而演化,這會導致和轉染相關的細胞行為的變化。如果隨時間發(fā)現這種變化,融化一管新鮮的細胞可能會恢復原先的轉染活性。比如,新鮮融化的NIH3T3細胞比傳代8次的細胞表現出更高的轉染效率,融化細胞的進一步傳代并沒有降低轉染效率。因此,如果觀察到轉染效率降低,可以試著轉染新鮮培養(yǎng)的細胞以恢復較佳結果。直到外源基因在細胞分裂過程中因各種因素丟失為止。天津細胞高效轉染試劑推薦廠家

通過緩沖液的作用以及脂質與內體膜融合,增大內體的內部滲透壓。珠海細胞高效轉染試劑直銷價

如何高效率實現細胞轉染:陽離子脂質體轉染試劑脂質轉染試劑,以其適用宿主范圍廣,操作簡便,對細胞毒性小,轉染效率高受到研究者們的青睞。脂質體(liposome)是一種人工膜,在水相中形成具有雙分子層結構的球形封閉囊泡。脂質體可以和帶負電荷的核酸結合后重新形成復合物,當復合物接近細胞膜時,通過內吞作用形成內體(endosomes)進入細胞,通過緩沖液的作用以及脂質與內體膜融合,增大內體的內部滲透壓,使內體結構破壞,釋放出核酸。隨后DNA復合物被釋放進入細胞核內。對于普通細胞系,一般的瞬時轉染方法多采用脂質體法。利用脂質體轉染法較重要的就是防止其毒性,因此脂質體與質粒的比例,細胞密度以及轉染的時間長短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉染效率的重要因素,通過實驗優(yōu)化合適的轉染條件對于轉染效率的提高很重要。珠海細胞高效轉染試劑直銷價

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