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蕪湖正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑單價(jià)

來源: 發(fā)布時(shí)間:2024-03-20

細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)簡介:實(shí)驗(yàn)材料與器材:1、材料293T細(xì)胞、MyoD表達(dá)質(zhì)粒和EGFP表達(dá)質(zhì)粒、DMEM培養(yǎng)基、鏈霉素/青霉素(雙抗)、FCS(小牛血清)、PBS(磷酸鹽緩沖溶液)、胰酶/EDTA消化液、轉(zhuǎn)染試劑(TransFast)2、器材20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip頭酒精燈、廢液缸、血球計(jì)數(shù)板、渦旋振蕩器、恒溫水浴箱、臺式離心機(jī)、35mm培養(yǎng)皿、轉(zhuǎn)染管、15ml離心管、觀察用倒置顯微鏡熒光顯微鏡和CCD。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法較重要的就是防止其毒性,因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例,細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染的時(shí)間長短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要問題,通過實(shí)驗(yàn)摸索的合適轉(zhuǎn)染條件對于效率的提高有巨大的作用。轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備①將400ul去核酸酶水加入管中,震蕩10秒鐘,溶解脂狀物。蕪湖正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑單價(jià)

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細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的方法有哪些:1..電穿孔法。通過短暫的高電場電脈沖處理細(xì)胞,沿細(xì)胞膜的電壓差異會導(dǎo)致細(xì)胞膜的暫時(shí)穿孔。DNA被認(rèn)為是穿過孔擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)的。電脈沖和場強(qiáng)的優(yōu)化對于成功的轉(zhuǎn)染非常重要,因?yàn)檫^高的場強(qiáng)和過長的電脈沖時(shí)間會不可逆地傷害細(xì)胞膜而裂解細(xì)胞。理論上說電穿孔法可用于各種細(xì)胞,且不需要另外采購特殊試劑,但需要昂貴的電轉(zhuǎn)儀。此法每次轉(zhuǎn)染需要更多的細(xì)胞和DNA,因?yàn)榧?xì)胞的死亡率高。每種細(xì)胞電轉(zhuǎn)的條件都需要進(jìn)行多次優(yōu)化。2.細(xì)菌介導(dǎo)的傳染。傳染需要將目的基因克隆到特定的細(xì)菌體系中,經(jīng)過包裝細(xì)胞的包裝得到改造后的細(xì)菌,再進(jìn)行傳染。優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)染效率特別高,尤其是難以轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞、細(xì)胞。缺點(diǎn)是構(gòu)建細(xì)菌周期長,環(huán)節(jié)多,易出錯,費(fèi)用也高。徐州正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑直銷廠家通過緩沖液的作用以及脂質(zhì)與內(nèi)體膜融合,增大內(nèi)體的內(nèi)部滲透壓。

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細(xì)胞轉(zhuǎn)染,你至少要掌握以下幾點(diǎn):主要有下面幾種方法::化學(xué)法:磷酸鈣法、DEAE-右旋糖苷法、陽離子脂質(zhì)體法;物理法:電穿孔法、顯微注射法、顆粒傳遞法;細(xì)菌介導(dǎo)法:逆轉(zhuǎn)錄細(xì)菌、腺細(xì)菌A.陽離子脂質(zhì)體法:帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞。特點(diǎn):簡單通用,適用性廣,轉(zhuǎn)染效率高,重復(fù)性好,但轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清,轉(zhuǎn)染效率隨細(xì)胞類型變化大。由于脂質(zhì)體復(fù)合物與貼壁細(xì)胞的接觸機(jī)會遠(yuǎn)大于懸浮細(xì)胞,所以貼壁比懸浮轉(zhuǎn)染效率要高。懸浮細(xì)胞建議使用電穿孔法。B.電穿孔法:利用高壓電脈沖對細(xì)胞膜的干擾,使其形成利于核酸進(jìn)入的微孔。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的常用方法:細(xì)菌轉(zhuǎn)染:原理:對于用脂質(zhì)體不能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,可以采用細(xì)菌轉(zhuǎn)染。可用于蛋白質(zhì)過表達(dá)或克制,是臨床研究中較常用的方法。它通過侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中,可用于難轉(zhuǎn)染細(xì)胞、原代細(xì)胞的穩(wěn)定性轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)步驟:通過基因克隆生成重組細(xì)菌→采用非細(xì)菌法轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系,擴(kuò)增并分離得到重組細(xì)菌顆粒→純化并滴定細(xì)菌液→轉(zhuǎn)導(dǎo)目的細(xì)胞(含有細(xì)菌特異性的受體)→去除培養(yǎng)物中的細(xì)菌,并加入新鮮培養(yǎng)基→分析細(xì)胞瞬時(shí)基因表達(dá)或沉默情況。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后,可在48h-72h細(xì)胞長滿之后,提取細(xì)胞蛋白或者RNA。

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細(xì)胞轉(zhuǎn)染的常用方法:人工脂質(zhì)體法原理:帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物,進(jìn)而可被細(xì)胞內(nèi)吞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染/瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染。這種方法幾乎適用于所有細(xì)胞,轉(zhuǎn)染效率高、重復(fù)型好,但轉(zhuǎn)染時(shí)需要去除血清,轉(zhuǎn)染效果隨細(xì)胞類型變化大。實(shí)驗(yàn)步驟:在單獨(dú)試管中分別稀釋核酸及轉(zhuǎn)染試劑→脂質(zhì)體與核酸的磷酸骨架結(jié)合,形成復(fù)合物→脂質(zhì)體上的正電荷有助于復(fù)合物與細(xì)胞膜結(jié)合→復(fù)合物通過內(nèi)吞作用進(jìn)入胞漿→分析細(xì)胞瞬時(shí)基因表達(dá)或沉默情況。來指示細(xì)胞中目標(biāo)基因是否存在,這樣的報(bào)告基因一般可以在轉(zhuǎn)染后一兩天內(nèi)檢測到。徐州深圳細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑

細(xì)胞鋪板密度用于轉(zhuǎn)染的較佳細(xì)胞密度根據(jù)不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。蕪湖正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑單價(jià)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法:1.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷,能與核酸的磷酸根通過靜電作用,將DNA分子包裹入內(nèi),形成DNA脂復(fù)合物,也能被表面帶負(fù)電的細(xì)胞膜吸附,再通過融合或細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中,是目前實(shí)驗(yàn)室較方便的轉(zhuǎn)染方法之一,其轉(zhuǎn)染率較高,優(yōu)于磷酸鈣法。由于脂質(zhì)體對細(xì)胞有一定的毒性,所以轉(zhuǎn)染時(shí)間一般不超過24小時(shí)。常用細(xì)胞類型:cos-7、BHK、NIH3T3、Hela等2.電穿孔轉(zhuǎn)染法電流能夠可逆地?fù)舸┘?xì)胞膜形成瞬時(shí)的水通路或膜上小孔促使DNA分子進(jìn)入胞內(nèi),這種方法就是電穿孔。當(dāng)遇到某些脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率很低或幾乎無法轉(zhuǎn)入時(shí)建議用電穿孔法轉(zhuǎn)染。一般情況下,高電場強(qiáng)度會殺死50%-70%的細(xì)胞。現(xiàn)在針對細(xì)胞死亡開發(fā)出了一種電轉(zhuǎn)保護(hù)劑,可以較大的降低細(xì)胞的死亡率,同時(shí)提高電穿孔轉(zhuǎn)染效率蕪湖正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑單價(jià)

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