鼠尾膠原實驗應(yīng)用：鼠尾膠原在原代培養(yǎng)耳蝸血管紋邊緣細胞中的應(yīng)用。目的：建立利用自制的鼠尾膠原培養(yǎng)大鼠耳蝸邊緣細胞的方法。方法:制作鼠尾膠原,并觀察利用自制的鼠尾膠原所培養(yǎng)出大鼠耳蝸邊緣細胞的效果。結(jié)果：自制的鼠尾膠原能正常地培養(yǎng)出大鼠耳蝸邊緣細胞，細胞角蛋白18表達陽性，免疫組織化學結(jié)果和掃描電鏡證實所培養(yǎng)的細胞具有典型的分泌上皮細胞特征。結(jié)論：成功建立了利用自制鼠尾膠原培養(yǎng)大鼠耳蝸邊緣細胞的方法，并且制作簡便,成本低廉。在冰水浴中將粉碎的鼠尾腱在醋酸溶液中溶脹。寧波廣州鼠尾膠原

酸解提取鼠尾Ⅰ型膠原及相對分子質(zhì)量和濃度檢測鼠尾肌腱在醋酸溶液的酸解作用下，其腱性組織被水解成膠凍狀溶液，從而分解成鼠尾Ⅰ型膠原蛋白分子。抽取鼠尾Ⅰ型膠原150μL滴在薄膜上，可形成液滴狀膠原蛋白凝膠(，其生物力學強度極差，一碰即散。將鼠尾膠原蛋白進行SDS-PAGE，結(jié)果顯示：Ⅰ型膠原蛋白原液在相對分子質(zhì)量130000附近有明顯條帶，另一條帶的相對分子質(zhì)量大于170000(圖2)。膠原蛋白濃度為1.8mg/mL。吸取礦化液倒入小培養(yǎng)皿中，將鼠尾Ⅰ型膠原纖維浸泡在礦化液中。礦化2、6d后，分別將礦化后的Ⅰ型膠原纖維進行TEM和電子衍射觀察。南京鄭州鼠尾膠原可以在無菌細胞操作室中暴光在紫外線下過夜消毒。在接種細胞前用無菌的水漂洗。

鼠尾膠原蛋白耗子尾汁還能變得更加，一種被稱作鼠尾膠原蛋白的“珍貴”液體就來自大鼠的尾巴，制作過程需要經(jīng)歷醋酸抽提、氯化鈉沉淀和磷酸氫二鈉沉淀等步驟，才能從鼠尾中獲得珍貴的膠原蛋白。這種膠原蛋白在37℃的條件下會形成3股螺旋結(jié)構(gòu)，可以用來當作細胞培養(yǎng)的基質(zhì)。細胞培養(yǎng)過程中，細胞需要貼附在培養(yǎng)皿表面（懸浮培養(yǎng)細胞除外）才能完成生長過程，而有一些細胞卻總是不太給力，自己完成不了貼壁過程或者貼壁困難，這個時候鼠尾膠原蛋白就能承擔起讓細胞更容易貼壁的作用。這一步也被稱作涂層（coating），給培養(yǎng)皿涂上了一層膠原蛋白后，細胞就能更好地貼附上去，除了培養(yǎng)皿，一些需要使用海藻碳酸鈣微球培養(yǎng)得細胞，同樣也可以用鼠尾膠原蛋白協(xié)助細胞貼壁生長。

鼠尾膠原蛋白的提取方法：1.將黏稠的膠體溶液進行高速冷凍離心處理，收集上清液；在冰水浴中，用的3?6mol/L的NaCl溶液緩慢加入上清液中，不斷攪拌至溶液中白色的絮狀物不再析出，4°C沉淀10小時，去除上清液，絮狀溶液高速冷凍離心處理，收集沉淀2.用0.03?0.06mol/L的檸檬酸溶液溶解沉淀物，成透明澄清黏稠溶液；在冰水浴中，調(diào)節(jié)pH=6.5，用的3?6mol/L的NaCl溶液緩慢加入上清液中，不斷攪拌至溶液中白色的絮狀物不再析出，4°C沉淀10小時，去除上清液，去除上清液，絮狀溶液高速冷凍離心處理，收集沉淀。使用溶解有一定比例胃蛋白酶的酸溶液對初步處理的鼠尾腱進行酶解。

鼠尾膠原蛋白Ⅰ型使用方法及注意事項：三維膠原的制備鼠尾膠原蛋白型在濃度1mg/ml以上，pH左右時可形成具有一定強度三維膠,建議成膠濃度1-2mg/ml。膠原蛋白溶解于0.006mol/L乙酸中，在成膠過程中需要加入0.06體積的0.1mol/LNaOH來中和。需要的溶液（均需要無菌、預(yù)冷）10mg/L酚紅用于pH指示）0.1mol/LNaOH，0.1mol/L乙酸(一般不用)，雙蒸水200ul鼠尾膠原蛋白型(5mg/ml)加到置于冰浴的離心管中，加入690ulH2O12ul0.1mol/LNaOH12ul0.1mol/LNaOH加到膠原溶液中，會由于NaOH不能迅速混勻而產(chǎn)生局部的膠原凝結(jié)）立即混勻。再加入100ul10PBS10培養(yǎng)液，混勻后立即加到培養(yǎng)器皿中(混勻后pH左右，如果PBS或培養(yǎng)液中沒有加酚紅，初次使用時需要用pH試紙測試)。鼠尾膠原、多聚賴氨酸和明膠作為基質(zhì)包被培養(yǎng)器皿。寧波廣州鼠尾膠原

膠原蛋白是脊椎動物和無脊椎動物支持結(jié)構(gòu)的主要組成。寧波廣州鼠尾膠原

要準備的器具：組織剪2把，有齒鑷1把，無齒鑷1把，200ml燒杯1個，培養(yǎng)皿1個，帶蓋廣口瓶1個，離心管、小瓶數(shù)個，滴管若干。以上物品須經(jīng)嚴格高壓消毒滅菌。需配制的液體0.1％醋酸溶液。經(jīng)44.48N10min高壓蒸汽滅菌(或是過濾除菌)后備用。此外還有用消毒雙蒸水配制75％酒精溶液。取大鼠尾巴，洗凈，置75%酒精浸泡消毒后，手持尾巴，用止血鉗夾住尾巴較高，折斷尾骨后拉出尾腱，將尾腱剪碎后置消毒的三角燒瓶中，稱尾腱的重量，按每克尾腱50ml的比例加入0.1%醋酸溶液，搖晃，使尾腱分散于醋酸溶液中，4℃放置48小時，離心。吸取其上清，分裝至小瓶，4℃保存。上述制備過程均在無菌條件下完成。寧波廣州鼠尾膠原