PCR(PolymeraseChainReaction)技術,即聚合酶連反應,是一種擴大和復制目的片段DNA的技術,其發現對于生命科學的發展具有重要的意義。而3D數字PCR到底是什么鬼?它其實是出現的一款PCR儀,其具有對目的DNA分子做出定量的優點,進而提供的準確性、靈敏度。應用該技術,實現對DNA進行精確定量,精確度可通過復制次數實現。通過準確性的進行定量檢測基因,有助于臨床上在、病毒等疾病作參考。同時,其具有高通量,檢測速度快,成本相對低等優點,為后期精細奠定基礎。拷貝數變異、突變檢測、基因相對表達研究、二代測序結果驗證、miRNA表達分析、單細胞基因表達分析等。珠三角微滴式數字PCR性能特點
PCR常使用目標序列的拷貝數或某一給定樣品中轉基因的百分比來體現方法靈敏度。由于qPCR和dPCR實驗過程所用試劑的兼容性較好,在使用dPCR進行轉基因檢測時,通常直接參照qPCR的方法。使用不同技術對相同樣品檢測時,兩種方法的靈敏度是否具有可比性成為關注的問題。Burns等21]使用Fluidigm公司的12.765(12板,每板765個微單元)芯片數字PCR分析儀測定標準物質ERM-AD413檢測轉基因玉米MON810。該小組應用dPCR技術評估在qPCR定義下的靈敏度數值,在拷貝數200-700之間,dPCR與qPCR的測量結果具有一致性。但與qPCR的靈敏度相比,dPCR在低于拷貝數200時有被低估的風險,在高于拷貝數1000時有被高估的風險。dPCR在同一陣列上同時測量轉基因和內源性靶點時,需要稀釋內源性靶點和轉基因靶點在合理拷貝數范圍內以保證dPCR測量結果的準確性。德國全自動數字PCR原理楊雁峰博士堅信數字PCR是可以應用于無創產前篩查的理想技術之一,這也是他2016年創立塔歌生物的初衷。
基于數字PCR技術平臺,塔歌生物成功地開發了胎兒染色體非整倍體(T21,T18和T13)無創產前篩查試劑盒(數字PCR-NIPT),并已完成數百例臨床樣本驗證。數字PCR-NIPT的陽性檢出率和NGS相似,且成本接近血清學,可以在上述應急策略中取代血清學作為靈敏度和特異性更高的初篩方法,以有效提高陽性檢出率,降低需要復篩的假陽性樣本數和節省總的篩查成本。數字PCR應用前景廣闊,可用于病原微生物檢測、基因檢測、無創產前篩查、測序結果驗證等領域。但目前,大多數醫院采購的數字PCR儀器是用于科研層面,在臨床應用上仍處于起步階段,未得到普遍應用。
數字PCR技術的出現不是為了完全取代原有分子診斷技術,而是更好的補充和完善現有技術平臺。數字PCR為不同應用場景下的多樣化核酸檢測需求提供了新的思路,尤其是在臨床檢測方面,在 性疾病早期檢測、 疾病的伴隨診斷、生殖遺傳篩查等領域展現出良好的應用前景。國產數字PCR企業在商業化應用方面,也不斷“攻城略地”。新羿生物在檢測及 疾病伴隨診斷方面開發了一系列試劑盒,并積極推進注冊臨床試驗;領航基因聚焦在血流 (膿毒癥)及呼吸道 領域,相繼推出了多款病原菌檢測試劑盒;銳訊生物聚焦于檢測,2020年其產品獲得FDA緊急授權。除此之外,在公共衛生領域,國產數字PCR企業針對食源性致病菌、鼠疫、蟲媒病毒等,也推出多種檢測試劑盒。目前dPCR中體積優化方法以光學顯微鏡觀測為主。
現有dPCR分析方法采用熒光探針和基于光的檢測方法來鑒定擴增產物。這些方法要求足夠的靶分子擴增以產生足以被檢測到的信號,但可能會導致額外的錯誤或偏差,因此,希望能夠提供一種改進的、用于檢測樣品內感興趣的核酸的方法,其采用替代性分析方法,具有提高的準確度和精確度,并且其具有可以與基于dPCR的方法關聯使用的靈敏度。dPCR還在樣品內進行單一反應,但是所述樣品被分離成大量的分區(partition),并且所述反應在每個分區中單獨進行。這種分離允許對核酸量進行靈敏的測量。DPCR已被證明可有效用于研究基因序列中的變異,例如拷貝數變異或點突變。數字以靈敏度和準確度測量突變的變異程度、檢測稀有的DNA靶拷貝以及解析拷貝數變?異狀態。深圳賽默飛數字PCR油滴制造
全自動數字PCR平臺,讓數字PCR真正邁入新時代,助推數字PCR普及應用。珠三角微滴式數字PCR性能特點
Drop-off實驗包括兩個針對相同擴增子的TaqMan探針:與野生型序列互補而與突變位點不發生互補的Drop-off探針和與突變型和野生型基因都互補的Reference探針(如圖1A)。在野生型等位基因的存在下,Drop-off探針和Reference探針都將與目標雜交,產生雙重陽性信號(如圖1B,藍色群)。相反,如果存在突變的等位基因,即使一個核苷酸的突變也會阻止Drop-off探針與之雜交,因此只有Reference探針對目標基因進行退火,從而得到一個陽性信號。珠三角微滴式數字PCR性能特點
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