微滴數字PCR主要是將兩種互不相溶的液體,以其中一種作為連續相(油),另一種作為分散相(水),在水/油兩相表面張力和剪切共同作用下分散相以微小體積單元的形式存在于連續中,從而成液滴。這種液滴式的反應腔室具有體積小、樣品間無擴散等優勢。在ddPCR中,利用微滴發生器可以一次生成數萬乃至百萬個納升甚至皮升級別的單個油包水微滴,作為數字PCR的樣品分散載體。這里,液滴中包裹了單拷貝DNA模板和PCR反應液,然后將液滴收集在PCR反應管中進行擴增。?PCR反應結束后檢測每個微滴的熒光信號。目前Bio-Rad公司的QX100系統、QX200系統均為采用液滴技術的數字PCR系統。圖6.Bio-Rad的液滴數字PCR系統數字PCR技術min檢測下限可到2copies/ml,比qPCR靈敏度提升了100倍。上海全自動多重數字PCR油滴制造
面對日益嚴格的限量標準和可預期降低的儀器購置成本,數字PCR將在食品檢測領域起到越來越重要的作用:同時,數字PCR技術帶來的量值的溯源方式,也將成為轉基因標準物質的主要研究方向。發展dPCR協同分析和自動化程度,使其具有更好兼容性、更低廉的成本,可使數據結果不間斷地納入到全食品安全全產業鏈中,從而在未來的食品檢測中得到更廣的應用。dPCR多重檢測可在不使用標準曲線的情況下,在同一分析過程中同時測定單一或多個轉基因與參考基因的比率,提高檢測的效率節省重復操作。美國全自動多重數字PCR油滴制造Drop-off數字PCR檢測方法的**主要優勢是能夠能夠在一個反應中檢測到基因組序列范圍短的同源基因突變。
全自動樣本制備系統DMX-1000配備氣流發生裝置和氣壓控制裝置,能夠實現高精度壓力控制,結合**產品液滴生成芯片和微流控乳液滴生成技術,DMX-1000可以在70秒內快速、穩定、高效地生成大小均一的微乳液滴。微滴數量可達2萬-60萬個,粒徑范圍30-120μm,性能穩定。除此之外,銳訊還提供微流控芯片的定制服務,以滿足不同的液滴數目和尺寸要求。平板式快速擴增儀TC-1000,不再使用傳統的96孔板,而是特制的液滴擴增芯片;不再是傳統的“燒開水”加熱模式,代之以平板式單液滴層均勻受熱的方式。在這樣的改進之下,TC-1000完成40個PCR循環只需約45分鐘(TC-2.0升級版更是把時間縮短到了25分鐘!),大幅縮短了等待時間,提升了實驗進度。這對實驗人員而言,無疑是莫大的福利——高效完成工作,不加班——愛工作,也愛生活。
對于檢測需要高靈敏度以及技術確認的情況下,數字PCR技術也可以發揮重要作用。技術數據表明,數字PCR技術對的比較低檢測下限可到2copies/ml,比qPCR靈敏度提升了100倍。經測試,數字PCR在檢測和診斷的某些方面優于金標準qPCR,尤其是在低病毒載量樣本中,相比起qPCR,數字PCR特異性、靈敏度、重現性和檢測限受影響更小。因此,未來預計數字PCR技術也將在類疾病中得到更加廣的應用。數字PCR的應用甚廣,除了可應用于進行突變的檢測以外,也可運用于基因擴增的檢測。通過數字PCR技術可建立多重熒光體系,用于同時檢測比如非小細胞肺中常見的MET和HER2耐藥擴增。有研究報道,使用數字PCR技術對436例非小細胞肺樣品進行檢測,并挑選樣本驗證了數字PCR與RNA fish的檢測一致性。結果表明,該數字PCR技術在保證了基因擴增檢測準確性的同時,還節約了檢測時間。在dPCR中,樣品被分區,使得樣品內單個的核酸分子被定位并被集中在許多分離的區域內。
Drop-off實驗包括兩個針對相同擴增子的TaqMan探針:與野生型序列互補而與突變位點不發生互補的Drop-off探針和與突變型和野生型基因都互補的Reference探針(如圖1A)。在野生型等位基因的存在下,Drop-off探針和Reference探針都將與目標雜交,產生雙重陽性信號(如圖1B,藍色群)。相反,如果存在突變的等位基因,即使一個核苷酸的突變也會阻止Drop-off探針與之雜交,因此只有Reference探針對目標基因進行退火,從而得到一個陽性信號。數字PCR作為研發階段的驗證方案之一。上海全自動多重數字PCR油滴制造
影響dPCR定量結果的因素:儀器采用的分散方式與數量、溶液稀釋方法、分散體積的準確性以及結果表達方式。上海全自動多重數字PCR油滴制造
無創產前篩查有望成為數字PCR在臨床快速落地的锏應用。首先,無創產前篩查領域對于兼顧成本、準確性、速度的創新技術的需求還未滿足。其次,無創產前篩查市場空間龐大,雖說中國每年新生兒的增長速度正在放緩,但每年仍有超過1000萬的新生兒,帶來了巨大的想象空間。2022年6月,鄭大一附院遺傳與產前診斷中心、塔歌生物聯合在JournalofTranslationalMedicine(影響因子5.531)雜志上發表文章,驗證了數字PCR作為T21,T18和T13產前篩查方法的可行性,這是世界上報道在真實臨床條件下通過盲檢實現一管反應可從孕婦血漿樣本中同時檢測出T21、T18和T13的數字PCR無創產前篩查試劑盒。文章顯示,塔歌生物胎兒染色體非整倍體無創產前篩查數字PCR試劑盒總體篩查的靈敏度為100%,特異性為95.12%,均優于血清學篩查。除準確率高之外,塔歌生物的產品還擁有成本低、操作簡便,及檢測速度快等優勢,可以加速無創產前篩查在各級醫院,特別是基層地區普遍落地,助力中國出生缺陷防控。上海全自動多重數字PCR油滴制造
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