共聚焦顯微可以呈現(xiàn)這么漂亮的圖像，是不是什么樣品都可以用共聚焦顯微鏡拍拍拍.....得到各種各樣清晰漂亮的圖像呢？答案是否定的，任何事物都有優(yōu)缺點，何況一臺儀器呢，共聚焦顯微鏡也是有自己的局限,共聚焦有哪些局限呢：1.共聚焦顯微鏡只能拍攝約200um以內的的樣品，對于厚的或者樣品不能進拍攝；2. 共聚焦顯微鏡由于是逐點進行掃描，對樣品的光毒性還是比較大的，特別是拍攝活細胞樣品時就更容易對樣品進行淬滅；3. 由于光照射的區(qū)域幾乎能通過這個Z軸的層面，所以對于空間定點光刺激的實驗定點位置就不是特別精確；并且激光共聚焦顯微鏡沒有純紫外進行激發(fā)，對于一些特殊激發(fā)波長的實驗，效率非常低。雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收 2 個長波長的光子，在經過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后，發(fā)射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有 100 飛秒，而其周期可以達到 80至100兆赫茲。雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化，結合它的特點，大致可以分成深和活兩個方面的提升。國內雙光子顯微鏡分辨率是多少

Winfried Denk較初使用的光源是染料飛秒激光器(100 fs脈寬、630 nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可，但是使用很不方便所以遠未實現(xiàn)商用。很快雙光子顯微鏡的標配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深，對生物樣品損傷更小。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置，鈦寶石飛秒可調諧激光器位于平臺較左邊?？茖W家正在從雙光子轉向三光子顯微鏡。1996年，Chris Xu在康奈爾大學(Denk同導師實驗室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡，如果雙光子吸收可行，那么三光子看起來也是自然的發(fā)展方向。三光子成像使用更長的波長，大約在1.3和1.7微米，其成像深度也比雙光子更深，目前記錄約為2.2毫米，人類大腦皮層厚約4毫米。相比雙光子顯微鏡，三光子還要求以較低重頻使用更強和更短的激光脈沖，而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達到這些要求，但是對于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)。進口熒光激光雙光子顯微鏡成像視野顯微成像技術包含：雙光子顯微鏡、寬場熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡、全內反射熒光顯微鏡等多種成像方式。

雙光子技術在醫(yī)療診斷應用中具有巨大的潛力，該領域還未形成標準和體系，需要系統(tǒng)的醫(yī)學研究與龐大的醫(yī)療數(shù)據(jù)加以支撐，通過研究人體基于多光子成像技術，進行細胞結構、生化成分、微環(huán)境、組織形態(tài)、代謝功能的影響信息，找到與疾病的細胞學、分子生物學、組織病理學、診斷和特征的關聯(lián)關系，共同探究生理病理基礎和分子細胞生物學機制，篩選鑒定、皮膚病、自身免疫病及其他疑難疾病的診斷及鑒別診斷依據(jù)，建立全新的多光子細胞診斷的完整數(shù)據(jù)庫，定義出針對不同疾病的多光子臨床檢測設備的產品標準。討論環(huán)節(jié)，來自病理科、呼吸中心、心臟科、神經科、皮膚科及研究所的多位醫(yī)師及研究人員紛紛結合各自的工作領域與王愛民副教授展開了熱烈的討論，其中毛發(fā)中心楊頂權主任計劃再次邀請王愛民副教授進行學術交流。通過本次學術交流，病理科與研究所分別與王愛民副教授課題組達成了初步合作意向。

雙光子顯微鏡是結合了雙光子激發(fā)技術和激光掃描共聚顯微鏡的一種新型熒光顯微鏡，其原理大致是這樣的：首先，讓我們來看看什么是熒光顯微鏡。熒光顯微鏡是以紫外線為光源，照射被檢物體上的熒光物質或是熒光染料，使其發(fā)出熒光。相比普通光學顯微鏡，熒光顯微鏡運用了波長更短的紫外線，再將可見光過濾掉，提高了分辨力率。而當被檢物體過厚時，從不同深度發(fā)出的熒光都會打在物鏡上，使觀察到的像模糊、發(fā)虛，無法清楚的知道被檢物體的結構。而激光掃描共聚顯微鏡就是在熒光顯微鏡的基礎上，增加了激光掃描裝置，從而解決了上述問題。雙光子顯微鏡可以進行厚的組織樣品拍攝。

許多生物醫(yī)學成像方式，無論是單光子(共聚焦)或多光子(雙光子)，都使用激光作為光源，并需要兼容的熒光染料。熒光染料有自己的激發(fā)波長，它們可以被單個光子以該激發(fā)波長的光子能量激發(fā)(E=hv=h*c/λ);或者是兩個幾乎同時到達的光子，但每個光子的能量約為單光子能量的一半，即雙波長(0.5E->2λ)。前者是單光子顯微鏡原理，后者是雙光子顯微鏡原理。在對同一種熒光染料進行成像時，雙光子與單光子相比可以使用約兩倍波長，因此雙光子的散射較小(波長較長，散射較小)，可以更深入地滲透到組織中。雙光子顯微鏡還可以對一些具有雙光子特性的染料細胞進行特定實驗；美國bruker雙光子顯微鏡磷光壽命計數(shù)

雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標本進行定點、有生命體的觀察！國內雙光子顯微鏡分辨率是多少

像差問題一直困擾著光學領域的工作者。像差會使光波前發(fā)生形變，不僅降低成像的信噪比和分辨率，使得很多時候我們只能“霧里看花”，更甚者，產生贗像，或無法獲得有意義的圖像。像差問題對雙光子成像的影響尤為嚴重，因為在那里，熒光信號對入射光強度的依賴是平方關系，一旦入射光波前形變，不僅聚焦強度大幅下降，成像分辨率也急劇惡化。因此，如何解決像差問題，實現(xiàn)，例如小鼠大腦皮層，深層區(qū)域的高質量成像成為光學成像發(fā)展中相當有挑戰(zhàn)性的問題之一。國內雙光子顯微鏡分辨率是多少