通過對微型光學系統的重新設計，FHIRM-TPM2.0成像視野擴大至420×420平方微米，微型物鏡的工作距離擴展至1毫米，以實現非侵入式成像；嵌入了可拆卸的快速軸向掃描模塊，實現了180微米深度的三維體成像和多平面快速切換的實時成像。該模塊由一個快速的電動變焦透鏡和一對中繼透鏡組成，在不同深度成像時保持放大倍率恒定。其中，變焦模塊重量1.8克，研究人員可根據實驗需求自由拆卸。此外，新版微型化成像探頭還可整體即時拔插，極大地簡化了實驗操作，避免了長周期實驗時對動物的干擾。在重復裝卸探頭追蹤同一批神經元時，視場旋轉角小于0.07弧度，邊界偏差小于35微米。雙光子顯微鏡已成為較厚有生命體生物組織三維成像中不可或缺的工具。熒光雙光子顯微鏡光毒性

在該自適應光學雙光子熒光顯微鏡中，她們將空間光位相調制器光學共軛到顯微物鏡的后焦平面，通過位相調制器將入射光分成若干子區域，每一塊子區域的波前都可以被控制。同時，她們用數字微陣列光處理器，以不同的頻率同時調制其中一半子區域的入射光強度，以另一半子區域作為“參考波前”。來自所有子區域光束會在焦點處會聚干涉，通過監測焦點激發的雙光子信號隨時間的變化情況，并進行傅里葉變換分析，可以“分解”得到被調制的每一塊子區域的“光線”的貢獻信息，從而可以實現對一半子區域波前的并行測量。對另一半子區域重復這一測量過程，從而獲得整個入射波前的信息并進行校正。該方法耗時很短，通常約1~3分鐘左右即可完成像差的測量和校正，無需復雜的計算，適用于任何標記密度和標記類型的樣品。更重要的是，得到的像差校正圖案可以用于提高較大視場范圍內的成像質量。該方法無疑為在體研究小鼠大腦皮層深層區域的生物、醫學問題提供了可行性方案。進口investigator雙光子顯微鏡光損傷雙光子顯微鏡使用長波長脈沖光，是通過物鏡匯聚的。

雙光子熒光顯微鏡是結合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發技術的一種新技術。雙光子激發的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子，在經過一個很短的所謂激發態壽命的時間后，發射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發熒光分子是相同的。雙（多）光子成像優勢在于，具有更深的組織穿透深度，利用紅外光，能夠在層面檢測極限達1mm的組織區域；因信號背景比高，而具有更高的對比度；因激發體積小，具有定點激發的特性，具有更少的光毒性；激發波長由紫外、可見光調整為紅外激發，能夠更加地安全。

與普通顯微鏡相比，電子顯微鏡可以在更小的尺度上觀察事物，冷凍電子顯微鏡可以觀察活性生物大分子。雙光子顯微鏡有什么優勢？它能做普通光學顯微鏡做不到的事情嗎？原來雙光子顯微鏡可以準確穿透厚標本進行定點和***觀察！因為電磁波的波長越短，粒子越強，散射的影響越大。雙光子顯微鏡將激發光源改為長波長激光，增加了激光的穿透力，同時降低了對細胞的毒性。此外，由于雙光子激發效應只能發生在物鏡的焦點處，因此掃描精度極高，還可以提高激發光效率，減少掃描點以外的熒光物質的消耗。如果已經有了飛秒光，就可以幾套雙光子顯微鏡共享一臺，只需分光即可。

利用鈣成像技術記錄大腦活動，隨著功能光學成像技術的發展，神經學家們已經可以研究腦區和神經元內部的工作情況。功能鈣成像技術就是其中之一，其主要原理是將外源性熒光信號和生理現象耦合起來——通過熒光染料信號的改變反映細胞內游離鈣離子濃度，以此細胞的功能狀態。目前它被廣泛應用于實時監測一群相關神經元內鈣離子的變化，從而判斷其功能活動。該技術的出現使得科學家可以親眼目睹神經信號在神經網絡之中時間和空間上的傳遞穿梭。在深度組織中以較長時間對細胞成像，雙光子顯微鏡是當前之選。國外雙光子顯微鏡授權公司

雙光子顯微鏡在多個領域研究中已有許多成功實例。熒光雙光子顯微鏡光毒性

和很多偉大的科學發明一樣，雙光子顯微鏡的出現也有一點偶然，但正是那瞬間的靈感為生物科學尤其是神經科學帶來了一種**性的成像技術：雙光子激發熒光顯微鏡。1990年初，當WinfriedDenk剛從康奈爾大學博士畢業準備前往瑞士讀博后時，他看了一本關于激光掃描顯微鏡的書，從中了解到非線性光學效應——強光和物質的相互作用。當時，Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒有強大的紫外激光器和光學元件，于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開紫外，換言之，與其通過一個紫外光子激發標記的鈣離子，通過兩個雙倍波長的可見光光子也能激發相同的熒光。有了想法后馬上實驗。借了一套染料飛秒激光器，Denk聯合他的導師WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六個小時就完成了實驗搭建，采集數據則用了兩到三天，于是一篇里程碑式的文章就此誕生了。熒光雙光子顯微鏡光毒性