雙光子技術在醫療診斷應用中具有巨大的潛力，需要系統的醫學研究與龐大的醫療數據加以支撐，通過研究人體基于多光子成像技術，進行細胞結構、生化成分、微環境、組織形態、代謝功能的影響信息，找到與疾病的細胞學、分子生物學、組織病理學、診斷和特征的關聯關系，共同探究生理病理基礎和分子細胞生物學機制，篩選鑒定、皮膚病、自身免疫病及其他疑難疾病的診斷及鑒別診斷依據，建立全新的多光子細胞診斷的完整數據庫，定義出針對不同疾病的多光子臨床檢測設備的產品標準。討論環節，來自病理科、呼吸中心、心臟科、神經科、皮膚科及研究所的多位醫師及研究人員紛紛結合各自的工作領域與王愛民副教授展開了熱烈的討論，其中毛發中心楊頂權主任計劃再次邀請王愛民副教授進行學術交流。雙光子顯微鏡工作原理是利用兩個光子的能量相加達到熒光激發能量閾值，來激發樣品中熒光分子發出熒光信號。國外bruker雙光子顯微鏡圖像對比度

基因編碼的熒光探針可用于在突觸和細胞分辨率下監測體內神經元信號，這是揭示動物神經活動復雜機制的關鍵。雙光子顯微鏡(2PM)可以對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器進行亞細胞分辨率的成像，從而測量不透明腦深部的活動。成像膜的電壓變化可以直接反映神經元的活動，但神經元活動的速度對于常規的2PM來說太快了。目前，電壓成像主要由寬視場顯微鏡實現，但其空間分辨率較差，且只能在淺深度成像。因此，為了以高空間分辨率成像不透明腦中膜電壓的變化，需要將成像速率提高2PM。面向模塊輸出端的子脈沖序列可視為從虛擬光源陣列發出的光，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成空間分離和時間延遲的聚焦陣列。然后，該模塊被集成到一個帶有高速數據采集系統的標準雙光子熒光顯微鏡中，如圖2所示。光源是重復頻率為1MHz的920nm激光器。FACED模塊可以產生80個脈沖焦點，脈沖時間間隔為2ns。這些焦點是虛擬源的圖像。虛光源越遠，物鏡處的光束尺寸越大，焦點越小。光束可以沿Y軸比沿X軸更好地填充物鏡，從而在X軸上產生0.82m和0.35m的橫向分辨率。國外bruker雙光子顯微鏡圖像對比度雙光子顯微鏡可精確穿透較厚標本進行定點、有生命體的觀察！

配合雙光子激發技術，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發揮功效。那么，什么是雙光子激發技術呢？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級，經過一個很短的時間后，電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子（P=h/λ）。利用這個原理，便誕生了雙光子激發技術。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光，通過物鏡匯聚，由于雙光子激發需要很高的光子密度，而物鏡焦點處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點處才能發生雙光子激發，產生熒光，該點產生的熒光再穿過物鏡，被光探頭接收，從而能夠達到逐點掃描的效果。

雙光子熒光顯微鏡是激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發技術相結合的新技術。雙光子激發的基本原理是:在光子密度較高的情況下，熒光分子可以同時吸收兩個波長較長的光子，經過短暫的所謂激發態壽命后，發射一個波長較短的光子；效果和用波長為長波長一半的光子激發熒光分子是一樣的。雙(多)光子成像的優點是具有更深的組織穿透深度，紅外光可以在平面上探測到極限為1mm的組織區域；因為信號背景比高，所以具有更高的對比度；由于激發體積小，具有定點激發、光毒性小的特點；激發波長由紫外、可見光調整為紅外激發，更加安全。如果已經有了飛秒光，就可以幾套雙光子顯微鏡共享一臺，只需分光即可。

首先我們來簡單介紹一下激光掃描共聚焦和雙光子這兩種當紅的顯微成像技術。激光掃描共聚焦顯微技術，是熒光顯微成像的一種，用于激發樣品的熒光信號并對其放大成像。在激光掃描共聚焦顯微鏡中，樣品焦平面上每一時刻只有一個點被激發光照射，縱然焦平面外也有激發光照射，但通過探測器前的（pinhole），有焦平面上的熒光信號能被探測器接收。也就是說，每個時刻，只有焦平面上一個點的信號被探測。通過點掃描的方式，一個個點的信號就可以組合出終的圖像。雙光子顯微鏡（包括多光子顯微鏡）同樣采用點掃描的方式得到圖像。不同的是，其采用的激發光波長較長，只有當兩個（或更多）激發光光子幾乎同時轟擊熒光探針的時候才可能激發出熒光信號。所以只有在光子密度特別大的焦點，出才會激發出熒光。也就是說，雙光子顯微鏡中，同樣每個時刻只有焦平面上一個點的信號被探測，并且連焦平面外的熒光信號也不會有。雙光子顯微鏡在各領域研究中已有許多成功實例。國內布魯克雙光子顯微鏡授權商

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在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收兩個長波長的光子，然后發射出一個波長較短的光子，其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發熒光分子是相同的（如下圖）。如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），在單光子激發時，在波長為350nm光的激發下發出450nm熒光；而在雙光子激發時，可采用750nm的激發光得到450nm熒光。由于雙光子激發需要很高的光子密度，為了不損傷細胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，從而可以減少光漂白和光毒性帶來的不利影響。國外bruker雙光子顯微鏡圖像對比度