多光子激發(fā)掃描顯微成像系統(tǒng)的不足。只能對熒光成像。如果樣品包括能夠吸收激發(fā)光的色團，如色素，樣品可能受到熱損傷。分辨率略有降低，雖然可以通過同時利用共焦的小孔得到改善，但是信號會有損耗。受昂貴的超快激光器限制，多光子掃描顯微鏡的成本較高。多光子激發(fā)顯微鏡應(yīng)用舉例。動物和腦片神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)與功能、動物腦皮層的成像、胚胎發(fā)育過程的長時間動態(tài)觀測、多光子激發(fā)光解籠、細胞內(nèi)微區(qū)鈣動力學、多光子激發(fā)自發(fā)熒光、其它應(yīng)用。從雙光子到三光子甚至四光子，這種非線性成像技術(shù)通常也被統(tǒng)稱為多光子顯微鏡。共聚焦多光子顯微鏡焦點激發(fā)

對兩個遠距離（相距大于1-2mm）的成像部位，通常使用兩條單獨的路徑進行成像；對于相鄰區(qū)域，通常使用單個物鏡的多光束進行成像。多光束掃描技術(shù)必須特別注意激發(fā)光束之間的串擾問題，這個問題可以通過事后光源分離方法或時空復用方法來解決。事后光源分離方法指的是用算法來分離光束消除串擾；時空復用方法指的是同時使用多個激發(fā)光束，每個光束的脈沖在時間上延遲，這樣就可以暫時分離被不同光束激發(fā)的單個熒光信號。引入越多路光束就可以對越多的神經(jīng)元進行成像，但是多路光束會導致熒光衰減時間的重疊增加，從而限制了區(qū)分信號源的能力；并且多路復用對電子設(shè)備的工作速率有很高的要求；大量的光束也需要更高的激光功率來維持近似單光束的信噪比，這會容易導致組織損傷。飛秒激光多光子顯微鏡三維分辨率多光子顯微鏡的發(fā)展現(xiàn)狀及未來發(fā)展趨勢。

多光子激發(fā)的特點。激發(fā)波長∶兩個或多個光子同時激發(fā)，激發(fā)波長是單光子激發(fā)波長的兩倍或多倍（i.e.紅光能激發(fā)UV探針）。多光子激發(fā)∶依賴于多個光子同時到達的時間。使用脈沖飛秒激光器（i.e.10-16seconds），且能提供更高的峰值功率。熒光限制在焦點處，能滿足多個光子同時達到產(chǎn)生多光子吸收。熒光強度正比于（激光強度）n。為什么使用飛秒激光器?多光子激發(fā)需要超快的激光器，皮秒脈沖不能實現(xiàn)三光子激發(fā)。深度成像需要更高、更窄脈沖輸出功率。多光子激發(fā)光源處于近紅外區(qū)，對細胞毒性和光漂白更小。

在多光子顯微鏡（也稱為非線性或雙光子顯微鏡）中，以兩倍正常激發(fā)波長照射樣品。更長的波長是有利的，因為它們可以更深地穿透樣品進行3D成像，并且因為它們不會損壞樣品，從而延長樣品壽命。為了實現(xiàn)多光子激發(fā)，照明光束在空間上聚焦（使用光學器件），同時使用高能短脈沖激發(fā)光束以提高兩個（或更多）光子同時到達同一位置（即熒光團分子）的概率。多光子顯微技術(shù)的例子包括二次諧波產(chǎn)生(SHG)、三次諧波產(chǎn)生(THG)、相干反斯托克斯拉曼光譜(CARS)和受激發(fā)射耗盡(STED)顯微技術(shù)。由于這些技術(shù)中的每一種都使用脈沖激光器，因此選擇能夠比較大限度地減少脈沖色散的光學組件很重要，并且激光反射二向色鏡應(yīng)具有低GDD特性。光子顯微成像技術(shù)不是什么新技術(shù)，早在20多年前就有了，目前已經(jīng)在生命科學和材料科學中廣泛應(yīng)用。

對于雙光子成像而言，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個比較大的深度限制因素，而對于三光子（3P）成像這兩個問題大大減小，但是三光子成像由于熒光團的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高數(shù)量級的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強度的熒光信號。功能性3P顯微鏡比結(jié)構(gòu)性3P顯微鏡的要求更高，它需要更快速的掃描，以便及時采樣神經(jīng)元活動；需要更高的脈沖能量，以便在每個像素停留時間內(nèi)收集足夠的信號。復雜的行為通常涉及到大型的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)既具有局部的連接又具有遠程的連接。要想將神經(jīng)元活動與行為聯(lián)系起來，需要同時監(jiān)控非常龐大且分布普遍的神經(jīng)元的活動，大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)會在幾十毫秒內(nèi)處理傳入的刺激，要想了解這種快速的神經(jīng)元動力學，就需要MPM具備對神經(jīng)元進行快速成像的能力。快速MPM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù)。從產(chǎn)品類型及技術(shù)方面來看，正置顯微鏡占據(jù)絕大多數(shù)市場。共聚焦多光子顯微鏡焦點激發(fā)

多光子顯微鏡在基礎(chǔ)科學和臨床診斷領(lǐng)域的應(yīng)用范圍正在持續(xù)增長。共聚焦多光子顯微鏡焦點激發(fā)

多光子顯微鏡通過引入具有超高透射率、非常陡峭的邊緣和精心優(yōu)化的阻擋的濾光片，為多光子用戶帶來了增強的性能。考慮到激發(fā)激光器和多光子成像系統(tǒng)的其他復雜元件通常需要多少投資，這些新的光學濾光片**了一種簡單且廉價的升級，可以顯著提高系統(tǒng)性能。事實上，與傳統(tǒng)濾光片的褐**調(diào)相比，發(fā)射濾光片看起來像窗戶玻璃一樣清晰，而且LWP二向色鏡具有如此寬的反射帶，它們看起來像高反射鏡。發(fā)射濾光片還在Ti:Sapphire激光調(diào)諧范圍內(nèi)提供深度阻擋，這對于實現(xiàn)高信噪比和測量靈敏度至關(guān)重要。共聚焦多光子顯微鏡焦點激發(fā)