酵母雙雜交還可以這么用？Y2H-seq 揭示不老松年齡。***小歐又給大家帶來了一篇酵母雙雜交結合高通量測序技術的應用文章。北京林業大學鈕世輝老師團隊，在傳統的酵母雙雜交技術流程基礎上，巧妙的結合了NGS技術，優化建立了Y2H-seq技術，**縮短了常規的篩庫后測序驗證周期，節約了實驗成本。文章中應用Y2H-seq技術，對不老松年齡密碼進行了有趣的研究，其中所用酵母雙雜交文庫由歐易生物協助完成。眾所周知，酵母雙雜交技術是研究蛋白相互作用的利器。目前已知的蛋白質相互作用至少有一半是通過酵母雙雜交技術發現的。但是做過酵母雜交實驗的小伙伴也都知道蛋白篩選較容易，但是篩選后，想知道獲得的陽性克隆都對應的是啥基因，所花費的人力物力相當不小。有困難解決困難，勇敢牛牛不怕困難。專業酵母文庫構建和篩選公司多年經驗。湖北酵母文庫

酵母雙雜交篩選實驗：為進一步了解LEA3蛋白在干旱脅迫下調控植物生長和增強抗旱性的分子機制，本研究以干旱脅迫條件下的棉花根莖葉為材料，構建了棉花干旱脅迫酵母文庫。并以GhLEA3為誘餌，采用酵母雙雜交篩選實驗，從棉花酵母文庫中篩選獲得了GhLEA3互作蛋白，并對互作蛋白進行了GO和KEGG分析，發現其中的互作蛋白GhVDAC1主要參與鈣信號通路和cGMP-PKG信號通路，互作蛋白Gh***A參與多種生物途徑，如糖原生成和代謝途徑。此外，GhVDAC1和Gh***A受干旱脅迫誘導表達***，且在GhLEA3敲除的棉株中表達量低于野生型棉株吉林生物技術酵母文庫歐易生物一直助力于各酵母文庫實驗室更好的使用該項技術，探索生命科學奧秘。

利用酵母雙雜交技術進行篩選，結果顯示SP8可以與水稻OsMYC3蛋白相互作用，并且二者互作關系通過酵母一對一互作、BiFC、Co-IP、LCI實驗得以驗證（圖A-C）。利用截短的SP8進行酵母一對一互作和Co-IP檢測表明，與OsMYC3的結合依賴于SP8的NTP結構域（圖D-E）；同樣，OsMYC3的TAD結構域也是二者互作所必不可少的（圖F）。酵母雙雜交、BiFC實驗表明，OsMYC3可以與OsJAZ相互作用。經茉莉酸處理，野生對照株根的長度明顯被抑制、一系列JA生物合成和信號傳導相關基因表達量上升，但Osmyc3突變體中抑制程度減輕、JA相關基因表達量上升減少。

小歐從2018年即開始關注酵母雜交與高通量測序相結合的技術發展，如2017年CaoGang老師等發表的RLL-Y2H技術，實現了文庫篩文庫可能，該技術通過對酵母雙雜常用載體的改造，并結合高通量測序，可直接獲得AD-BD互作蛋白對。所用方法相當巧妙，感興趣的同學請點擊《當酵母雙雜交遇到高通量測序》。鈕老師團隊之前的研究已經鑒定了DAL1作為一種保守的針葉樹年齡生物標記基因，在油松從營養生長到生殖生長的時相轉變過程中起重要作用。為了進一步理解年齡效應如何驅動針葉樹的發育，闡明與DAL1相關的蛋白互作網絡很關鍵。鈕老師團隊利用傳統的Y2H篩選技術結合NGS測序技術，優化得到了Y2H-seq技術，與傳統的篩選測序相比，大幅度節省了時間和實驗成本。酵母文庫構建的目的酵母的做法。

酵母雙雜交、pulldown和BiFC實驗均顯示，MdTRB1可以通過其C末端與JAZ1蛋白互作。在蘋果葉片和愈傷組織中過表達MdJAZ1，花青素和原花青素的累積受到明顯抑制。在蘋果葉片和愈傷組織***表達MdJAZ1/MdJAZ1，結果顯示過表達MdJAZ1抑制了MdTRB1對花青素和原花青素累積的促進作用。Pull down 實驗和熒光素酶互補成像實驗結果表明，在 MdJAZ1 存在下，MdTRB1 與 MdMYB9 的結合減弱（圖 a-c）；外源施加 JA 可以部分恢復 MdTRB1 與 MdMYB9 的結合。對于 MdTRB1 在 JA 介導的花青素和原花青素積累中的作用機制，本研究建立了一個新的模型：MdTRB1 通過與 MdMYB9 互作，增強了 MdMYB9 對下游基因的轉錄***活性，進而正向調節了 JA 介導的花青素和原花青素累積。在 JA 缺乏的條件下，MdJAZ1 與 MdTRB1 互作，干擾了 MdTRB1 與 MdMYB9 之間的結合；在 JA 存在的條件下，MdJAZ1 被降解，MdTRB1 被釋放出來以參與后續過程。從該技術開發以來，雙雜交和三雜交報告基因數量從1個報告基因增加到了4個，降低了假陽性概率。湖北酵母文庫

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酵母單雜交結果顯示，磷酸鹽饑餓響應因子OsPHR1/2/3可以***51個目標啟動子中的25個，包括OsRAM1、OsRAD1、OsWRI5A等。OsRAM1、OsRAD1、OsWRI5A自身又可以調控許多菌根共生相關基因的表達（圖A）。對叢枝菌根共生響應基因啟動子序列預測分析顯示，有78個轉錄因子被富集，87%的菌根共生響應基因受到OsPHR1/2/3的調控，其中42%受到OsPHR1/2/3的直接調控。因此推測OsPHR1/2/3可能是菌根共生調控網絡中的一個關鍵調控樞紐（圖A-B）。EMSA和熒光素酶報告實驗證實，OsPHR12可以直接結合并***OsRAM1、OsWRI5A、OsPT11、OsAMT3啟動子序列（圖C-F），并且這種結合依賴于啟動子中的P1BS元件（圖G）。湖北酵母文庫

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