定量實時聚合酶鏈反應(qPCR)廣用于特異性核酸的第三方檢測,RNA轉錄物豐度的測量和高通量實驗結果的驗證。qPCR通常在標準的96孔板上進行,現在實驗室里的qPCR就像移液器和燒杯那樣常見。在引物設計和功能分析方面,NCBI里的數據已經很多了。但這些數據只是理論上的,在具體實驗操作中還要經過各種復雜的計算和實驗。在以前的qPCR中,為了使測定正常進行,通常需要進行大量耗時的反復試驗。而現在,這些步驟都可以通過數據預實驗來完成。更方便的是,已經有人把qPCR實驗中所用到的各種工具都整合到了一個工具箱里。比如,Biosearch這個網站里,就有一個成套的qPCR工具箱OligoToolbox,其中包含的工具能做很多實驗計算工作。瑞普信生物技術有限公司第三方檢測細胞實驗。四川熒光定量第三方檢測公司
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磷酸化蛋白的WB第三方檢測在實操過程中有哪些注意事項?“研究完某一蛋白的磷酸化情況后比較好也要研究一下該蛋白總的表達量 ”。這有兩種方法,一是:相同的 sample 在不同的 well 中上樣兩次,可在相同的gel上,也可在不同的gel。其一壓磷酸化蛋白,另一壓該蛋白總的表達量(包括磷酸化和未磷酸化的該蛋白),甚至還可跑另一個 gel ,壓內標。但是本人不建議如此做,因為這樣比較時誤差還是較大的。因此,比較公認的,本人也建議如此的方法,即:將原先結合上的磷酸化抗體及二抗用 strip solution 洗去。
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“做miRNA下調,QPCR檢測miRNA,表達水平無變化”,這到底是怎么回事?現有miRNA抑制手段,無論是基于載體構建的、還是化學合成的,本質上都是用跟成熟體互補的反義miRNA(miRNA海綿體屬于不完全互補的反義RNA重復),其可以通過結合miRNA,阻斷其與靶基因結合,但并不能有效引發miRNA的降解,原因有兩方面:其一是反義RNA與miRNA結合后,序列很短,導致Dicer酶(細胞內降解雙鏈RNA的主角)不能有效結合;其二是miRNA與Ago2以RISC復合物的形式存在,該復合物也會導致Dicer酶無法高效結合。因此,如果以反義RNA技術抑制miRNA功能,QPCR可以做,如果檢測出表達水平下降還好,即便未檢測到,也不表示抑制無效,正確的做法是直接檢測目的基因蛋白水平是否有上調。但若實驗者不清楚靶基因的情況下,不檢測到miRNA下調,心里是沒底的。第三方檢測實驗技術哪家強?就找瑞普信!四川熒光定量第三方檢測公司
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