③待分離膠完全聚合后，傾去其頂部的去離子水，用濾紙將水吸干。④配制4％濃縮膠5mL，加TEMED5μL、10％APS50μL，混勻立即灌膠，灌至頂部，并垂直插入Teflon齒梳，室溫靜置20min待膠聚合。⑤待膠完全聚合后拔出梳子，將凝膠置于電泳槽中，加入電泳緩沖液，用電泳緩沖液沖洗上時間就是金錢，效率就是生命唯有惜時才能成功，唯有努力方可成就樣孔以去除氣泡。2電泳①取各個處理組蛋白提取液，調整蛋白濃度為6μg/μL，和等體積2上樣緩沖液混合，即為上樣液。②將上樣液于100℃沸水中煮沸5min，使蛋白變性，冰上驟冷，3000轉/min離心1min。③每孔加上樣液15μL，留一孔加10μL預染的Marker。加滿電泳緩沖液，蓋上槽蓋，接通電源，先用80v恒壓電泳，約20min，當指示劑溴酚藍進入分離膠后改用110v恒壓電泳，當指示劑到達距凝膠下端約處時關閉電源，取出膠板。3轉印蛋白及免疫檢測①在電泳即將結束前，預先將PVDF膜浸泡在甲醇中15s，然后用ddH2O漂洗2min，浸泡于轉移緩沖液中5min后開始后續操作。②在水中撬膠，修膠后將膠浸泡于轉移緩沖液中平衡15min。③按黑面（負極）→海綿→濾紙→膠→PVDF膜→濾紙→海綿→紅面（正極）的順序制備轉膜“三明治”。瑞普信第三方檢測實驗效果怎么樣？四川免疫組化抗體第三方檢測公司

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磷酸化蛋白的WB第三方檢測在實操過程中有哪些注意事項？細節決定成敗，在科研中更是如此。1.一定要在lysisbuffer中加入蛋白酶抑制劑，還要加入一定量的磷酸酶抑制劑，否則即使band壓出來也會很淺，結果也不可信。2.加一抗后比較好4度過夜，保證抗體有充分的結合時間。因為磷酸化的蛋白只占總的蛋白量的極少部分。二抗則室溫1小時即可。3.磷酸化抗體的好壞是一個關鍵因素，所以要選擇好的廠商。務必找專業的磷酸化抗體公司訂購。4.比較好根據廠商的protocol來操作實驗，這是實驗成功的保證。5.抗體的稀釋倍數也要適當。不同廠商也會有不同要求。

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