關(guān)于單細(xì)胞測(cè)序?qū)嶒?yàn)樣本制備，這與流式細(xì)胞術(shù)用戶熟悉的步驟完全一致，也就是通過(guò)酶促或機(jī)械消化、細(xì)胞分選或其他細(xì)胞分離技術(shù)從整個(gè)樣本中制備生成活的單細(xì)胞懸液。隨后是細(xì)胞計(jì)數(shù)和質(zhì)量控制步驟，以確保您的樣本有適當(dāng)濃度的活細(xì)胞，并且不含細(xì)胞團(tuán)塊和死細(xì)胞碎片。如有必要，您還可以使用抗體對(duì)樣本進(jìn)行染色，標(biāo)記細(xì)胞表面蛋白或其他生物分析物，或者通過(guò)FACS來(lái)富集感興趣的細(xì)胞類型。解離樣本時(shí)采取的具體步驟將根據(jù)您的起始材料和實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)而定。也許需要額外的制備步驟，具體取決于組織質(zhì)量、樣本豐度、細(xì)胞大小，以及是否需要提取出細(xì)胞核進(jìn)行染色質(zhì)可接近性分析。無(wú)論具體的考慮因素如何，所有樣本類型都遵循同一個(gè)基本原則，那就是生成高質(zhì)量的單細(xì)胞懸液。烈冰單細(xì)胞多組學(xué)測(cè)序助您探究細(xì)胞類型特異性和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)特征。北京10X Chromium X單細(xì)胞測(cè)序百萬(wàn)通量平臺(tái)

高通量測(cè)序技術(shù)（High-throughput sequencing）又稱“下一代”測(cè)序技術(shù)（“Next-generation” sequencing），以能一次并行對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定和一般讀長(zhǎng)較短等為標(biāo)志。高通量測(cè)序技術(shù)是對(duì)傳統(tǒng)測(cè)序一次顛覆性的改變，一次對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定，因此在有些文獻(xiàn)中稱其為下一代測(cè)序技術(shù)(next generation sequencing)足見(jiàn)其劃時(shí)代的改變，同時(shí)高通量測(cè)序使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的 分析成為可能，所以又被稱為深度測(cè)序(deep sequencing)。而烈冰科技具有專業(yè)生物背景和十二年科研服務(wù)經(jīng)驗(yàn)，已助力Nature，immunity等在內(nèi)的300+篇CNS文章發(fā)表。上海10X Chromium X單細(xì)胞測(cè)序多組學(xué)測(cè)序測(cè)序的革新讓科學(xué)研究從個(gè)體基因差異逐漸轉(zhuǎn)為個(gè)體細(xì)胞的基因差異。

單細(xì)胞測(cè)序?qū)嶒?yàn)再樣本細(xì)胞上機(jī)分選簽，需要對(duì)細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞活性進(jìn)準(zhǔn)判斷，這對(duì)Single Cell分選標(biāo)記、建庫(kù)、下機(jī)數(shù)據(jù)的質(zhì)量都具有著決定性的作用。如若細(xì)胞計(jì)數(shù)偏高，將會(huì)影響建庫(kù)的成功率；計(jì)數(shù)偏低，則會(huì)提高雙細(xì)胞的比例；而細(xì)胞活率過(guò)低，就會(huì)使測(cè)序數(shù)據(jù)的利用率大打折扣，因此把好單細(xì)胞懸液質(zhì)量這一關(guān)尤為重要。而在鋪板過(guò)程中，由于不同操作人員手法具有不可避免的差異，不同的液體流速將直接影響單細(xì)胞的入孔效果。因此烈冰生物BD Rhapsody單細(xì)胞分選平臺(tái)配套了專門(mén)定制的電動(dòng)移液器，其具有Prime Treat、Cell Load、Bead Load、Wash、Lysis、Retrieval多種操作模式，來(lái)對(duì)應(yīng)各種不同的操作。通過(guò)已經(jīng)設(shè)定的程序來(lái)控制液體的流速，大幅度降低人為操作習(xí)慣帶來(lái)的差異，保證實(shí)驗(yàn)操作的一致性。

樣本制備后的保存 為了盡可能地減少轉(zhuǎn)錄組的變化，在對(duì)細(xì)胞進(jìn)行清洗和計(jì)數(shù)后，單細(xì)胞懸液應(yīng)當(dāng)保存于冰上，直至用于后續(xù)的上機(jī)和文庫(kù)制備步驟。在理想狀況下，一旦制備好樣本，應(yīng)當(dāng)在3min鐘內(nèi)將其用于下游步驟。然而，您還有必要了解各類細(xì)胞的不同性質(zhì)，因?yàn)檫@可能會(huì)影響細(xì)胞應(yīng)在冰上保存的時(shí)間，以及它們?cè)谥苽浜蠖嗑帽銘?yīng)當(dāng)被盡快使用。例如，有些細(xì)胞（如PBMC）如果在冰上放置一段時(shí)間，它們就開(kāi)始形成團(tuán)塊。這些團(tuán)塊很難解離，增加了堵塞的風(fēng)險(xiǎn)，而且每個(gè)團(tuán)塊被當(dāng)成單細(xì)胞計(jì)數(shù)，又降低了細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。此外，有些細(xì)胞更加粘稠，形成團(tuán)塊的速度更快。對(duì)于這些細(xì)胞，必須盡量減少制備和使用之間的時(shí)間差。單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)，烈冰提供高性價(jià)比服務(wù)方案。

單細(xì)胞RNA-seq、RNA-seq和逆轉(zhuǎn)錄qPCR（RT-qPCR）都采用一個(gè)共同過(guò)程，即分離RNA并將其轉(zhuǎn)化為cDNA進(jìn)行分析。不過(guò)，每種分析在開(kāi)展方式和獲得的數(shù)據(jù)上有所不同。RNA-seq和RT-qPCR都是先從大量細(xì)胞中分離RNA，然后將其轉(zhuǎn)化為cDNA。RNA-seq是使用cDNA來(lái)構(gòu)建新一代測(cè)序文庫(kù)，從而測(cè)定整個(gè)轉(zhuǎn)錄組的基因表達(dá)。RT-qPCR則是從cDNA中擴(kuò)增特定靶點(diǎn)，并通過(guò)熒光測(cè)定表達(dá)水平。RT-qPCR限于已知靶點(diǎn)，而RNA-seq可實(shí)現(xiàn)無(wú)偏倚的全轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)分析。然而，這兩者只能提供細(xì)胞群體內(nèi)基因表達(dá)的平均情況。單細(xì)胞RNA-seq則在分離RNA之前將單細(xì)胞分離到微孔或單個(gè)微反應(yīng)容器中。然后用細(xì)胞特異性的條形碼標(biāo)記RNA，確保來(lái)自每個(gè)細(xì)胞的cDNA可以追溯到起源細(xì)胞。與RNA-seq相似，帶有條形碼的cDNA也被用于構(gòu)建新一代測(cè)序文庫(kù)，從而能夠?qū)γ總€(gè)細(xì)胞的整個(gè)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行基因表達(dá)測(cè)定。烈冰測(cè)序服務(wù)已助力300余篇國(guó)際期刊研究文章發(fā)表。蘇州10X Genomics單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)支持

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一味的追求高細(xì)胞數(shù)量的捕獲，小心得不償失，原因在這：?jiǎn)渭?xì)胞測(cè)序所有的分析都是基于細(xì)胞聚類進(jìn)行，而細(xì)胞聚類是在區(qū)分cell和non-cell后，獲得細(xì)胞基因表達(dá)譜，通過(guò)降維（pca），無(wú)監(jiān)督聚類以及可視化（t-SNE）得到的。進(jìn)行細(xì)胞聚類時(shí)需要考慮到每個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)模式，因此即使是相同的數(shù)據(jù)，在剔除幾個(gè)細(xì)胞的情況下，前后獲得的聚類圖也會(huì)出現(xiàn)明顯不同。而當(dāng)細(xì)胞捕獲數(shù)過(guò)多時(shí)，無(wú)論是假陰性和假陽(yáng)性數(shù)據(jù)還是多細(xì)胞數(shù)據(jù)，都會(huì)對(duì)正常細(xì)胞聚類產(chǎn)生影響，造成聚類結(jié)果失真。這也是很多文章，特別是很多高分文章，為什么單個(gè)樣本捕獲細(xì)胞數(shù)在2000-3000的原因了。烈冰建議單個(gè)樣本捕獲細(xì)胞數(shù)在3000-5000個(gè)時(shí)，數(shù)據(jù)量在100G左右時(shí)，可以滿足分析和文章發(fā)表的多重需求。北京10X Chromium X單細(xì)胞測(cè)序百萬(wàn)通量平臺(tái)

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