聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction，PCR)提出至今已有20年時間，期間PCR已發展成為分子生物學領域的一項關鍵技術和常規技術，極大地推動了生命科學各個領域的發展。特別是90年代后期，美國ABI公司推出的實時熒光定量PCR(realtimePCR，qPCR)技術及相關產品更是將PCR由體外合成及定性/半定量檢測技術發展成為一種高靈敏、高特異性和精確定量的基因分析技術。盡管經過十幾年時間的迅速發展，qPCR 技術已經用于除外傷和營養缺乏癥外所有疾病的診斷，但是，在 PCR擴增過程中影響其擴增效率的因素有很多，不能保證在反應過程中擴增效率保持不變和實際樣品與標準樣品以及不同樣品之間的擴增效率是相同的，由此導致其定量分析所依賴的基礎——循環閾值(CT)不是恒定不變的。因此 qPCR 的定量只是“相對定量”，其準確度和重現性依然不能夠滿足分子生物學定量分析的要求。通過直接計數或泊松分布公式計算得到樣品的原始濃度或含量。山東高精確度數字PCR方案

該技術提出至今雖然只有十幾年時間，但是由于其獨特的技術優勢和應用前景，使得其產業化發展相當迅速。迄今為止，已有包括Fluidigm和 Bio-Rad等幾家公司相繼推出了數字 PCR 產品，并已經應用于單細胞分析、**早期診斷和產前診斷等研究領域。目前，有關數字 PCR 技術的綜述類文獻并不多見，本文將在現有文獻基礎上，對該技術的原理、定量方法、分類及應用進行評述，并對發展趨勢進行展望。數字 PCR 技術提出至今，相關技術和產業化發展都非常迅速。迄今為止，數字 PCR 技術主要有三類: 微反應室/孔板、大規模集成微流控芯片和液滴數字PCR系統。廣東高精確度數字PCR整個實驗流程可在2小時內完成。

甲基化含量鑒定：傳統的亞硫酸氫鹽處理后的克隆測序法、抗體檢測法、定量PCR檢測法等受限于方法學的問題，不能獲得甲基化程度的精確定量，而數字PCR系統通過對樣品的微液滴處理及目標分子的***拷貝數定量，為甲基化程度的精確定量檢測提供了一種可靠的技術。二代測序輔助建庫：目前靶向測序建庫方法包括擴增子方法，在均相溶液中，當擴增引物增加時，由于擴增引物之間的相互作用，從而影響擴增的效率；如果將其分散到大量微液滴中擴增，將可**降低引物間相互作用，提高擴增效率。同時還可以實現對于少量模板的有效擴增，得到更多的有效測序數據。

拷貝數變異(CNV)研究：數字PCR直接讀取陽性信號，通過泊松分布校正得到目標基因的***拷貝數，為拷貝數變異的研究提供了***的檢測精度。采用數字PCR能夠有效對二代測序（NGS）和微陣列比較基因組雜交（aCGH）等實驗結果進行驗證，并具有檢測周期短、成本低、樣本通量高等特點。低豐度DNA模板分子的精確定量：由于絕大部分微液滴中只含單個或不含模板分子，使得低豐度DNA模板分子的擴增不受高豐度模板分子擴增的競爭抑制：與此同時，樣品中可能存在的抑制劑也在分配到微液滴的過程中進行了相對稀釋，作用于單個微液滴內模板擴增的抑制劑數量大幅降低，從而提高PCR擴增對抑制劑的耐受程度，因此可應用于諸多臨床樣品（如血液、尿液、糞便、痰液、胸腹水、腦脊液等）中痕量核酸標記物的檢測。一般而言，定量PCR的檢測靈敏度約在1%，NGS的靈敏度可達到1%，而數字PCR的檢測下限可輕松實現0.01%。可以用來檢測外泌體micRNA。

肺*的ALK融合基因檢測：ALK融合基因是NSCLC患者另外一個常規的伴隨診斷，可以指導ALK-TKI藥物的使用，目前已發現20種以上EML4-ALK的融合形式，多個報道證實它們中大部分能促進**生成。另外ALK還可能與TFG、KIF5B、KLC1、PTPN3、STRN等基因發生融合，因此ALK融合突變的診斷具有一定難度。目前臨床常規使用的檢測手段包括免疫組化（Immunohistochemistry，IHC），熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）以及RT-PCR等三種。這三種方法各具優缺點：IHC相對簡單，價格低廉，但是容易受到主觀判斷的影響；FISH可以檢測各種融合類型，但是操作繁瑣，價格昂貴；RT-PCR方法的特異性較好，結果客觀，但是只能針對已知類型。近期有研究者采用數字PCR，利用ALK基因3’端的過表達來鑒定ALK的融合，該方法既具有PCR方法特異性好、結果客觀的優勢，同時又不受融合類型的限制，可以檢測所有融合型，在與三種傳統方法的對比過程中展現出了更好的臨床符合率，未來有望成為一種新的常規檢測手段。開發多靶點檢測的多重數字PCR檢測，可以通過多種熒光染料或標記技術來實現。云南數字PCR數字PCR專業服務

對引物的特異性要求高。山東高精確度數字PCR方案

CRISPR-Cas9基因編輯結果驗證：CRISPR-Cas9技術的發明，是基因編輯技術的一大突破，但如何驗證實驗是否成功，仍需要高靈敏度的檢測方法，數字PCR技術可以滿足這一需求。Broad研究所張鋒團隊發明了以CRISPR為基礎的SHERLOCK技術可以對核酸進行高靈敏度的定性檢測，但精確定量評估時仍采取了數字PCR進行確認。*****的伴隨診斷：常用體液來源（如血液，胸腹水，唾液及尿液等）的待檢標本中的DNA，有正常脫落體細胞和病變脫落細胞兩種來源，前者的量遠大于后者。通過微液滴處理能在每個微液滴中有效減少正常體細胞DNA的干擾，實現**標記物的有效檢測，如EGFR，ALK，ROS1，KRAS、BRAF等基因的突變檢測、乳腺*/胃*的HER2基因擴增檢測等，應用于**精細醫學的伴隨診斷。山東高精確度數字PCR方案