industryTemplate常見的300種人、小鼠和大鼠基因表達Assay均已在QIAcuity數字PCR平臺上經過驗證。天津Digital PCR數字PCR服務

與傳統qPCR技術相比，數字PCR技術具有極高的靈敏度、特異性和精確性，但截止目前而言，數字PCR對廣大科研工作者仍然是一種全新的檢測方法，我們在看待數字PCR的應用前景時，更應該保持一種開放的心態，與其說數字PCR技術是一個新的檢測平臺，不如把它視為一種全新的技術思路和手段，在這個平臺上必將有更多的應用幫助我們深入到分子生物學研究的更高層次。數字PCR被稱為第三代PCR技術，相比于傳統的PCR技術和熒光定量PCR技術，其具有諸多優勢：（1）***定量，不依賴標準品和參考曲線，定量結果更加準確可靠；（2）高靈敏度，可實現單分子級檢測；（3）高分辨率，適合在大量背景模板的干擾下對罕見的目標分子進行檢測；（4）高穩定性，對抑制劑的耐受程度**增強。憑借這些優勢，數字PCR被廣泛應用于多個不同的領域[4]，特別是生物醫學領域，包括稀有突變檢測、基因拷貝數變異檢測、基因表達研究、甲基化水平檢測、**液體活檢、無創產前檢測、微生物（病毒、細菌等）檢測、移植排斥監控和二代測序輔助建庫等。此外，此技術也被用于農業、食品安全和環境科學等諸多領域。PCR數字PCR共同合作一般需要將樣品稀釋到單分子水平，并平均分配到幾十至幾萬個單元中進行反應。

值得注意的是，在gDNA長度≥20kb或進行拷貝數變異檢測實驗時，必須對樣品進行酶切處理，確保大片段DNA序列或串聯序列在酶切處理后，模板隨機且均勻的進入**反應體系，以實現準確和精確的定量。數字PCR實驗離不開包含有Mg2+、dNTP、Buffer和DNA聚合酶等PCR反應所需要的MasterMix。隨著實驗的不斷深入，對于實驗條件的要求也不斷提高，其中DNA聚合酶對實驗的準確性起著至關重要的作用。由于非熱啟動的DNA聚合酶在反應體系易使引物在室溫條件下發生非特異性擴增，直接影響實驗結果。

20 世紀末，Vogelstein等提出數字PCR(digital PCR，dPCR) 的概念，通過將一個樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應單元，每個單元包含一個或多個拷貝的目標分子( DNA 模板) ，在每個反應單元中分別對目標分子進行PCR擴增，擴增結束后對各個反應單元的熒光信號進行統計學分析。與 qPCR 不同的是，數字PCR不依賴于CT值，因此不受擴增效率影響，擴增結束后通過直接計數或泊松分布公式來計算每個反應單元的平均濃度(含量)，能夠將誤差控制在5%以內，數字PCR 可以不需要對照標準樣品和標準曲線來實現***定量分析。通過直接計數或泊松分布公式計算得到樣品的原始濃度或含量。

ddPCR主要有Bio-rad公司開發的QX200系統和Rain Drop系統，QX200可以將體系分割成2萬個微滴，Rain Drop可以分割成100萬-1 000萬個微滴。ddPCR原理是通過將一個待分析的PCR反應體系進行微滴化處理，利用微滴發生器制成近20 000個油包水小微滴從而對原始體系進行分割，樣品中的核酸分子隨機分配到大量**的微滴中，每個微滴中含有一個或不含待檢核酸分子。對微滴體系進行擴增反應以后，分析每個微滴的熒光信號，進行有或無的判斷，將判斷結果按照泊松分布的原理，通過讀取靶標和內參核酸的陽性微滴個數以及比例從而得到靶分子的拷貝數及濃度。與芯片式dPCR相比，操作簡單，可以實現高通量的檢測，也保證一定程度上的微滴檢測穩定性。影響引物探針特異性的因素有很多種，譬如純化方式、設計方法以及引物探針的修飾技術等。PCR數字PCR共同合作

開發多靶點檢測的多重數字PCR檢測，可以通過多種熒光染料或標記技術來實現。天津Digital PCR數字PCR服務

單細胞的基因表達分析：基因表達分析有助于了解細胞和組織的特征及其如何應對發育和環境信號的改變。檢測已知和未知基因轉錄水平的方法在過去的四十多年來發生了翻天覆地的變化，變得更加有效，更加敏感，定量更加精細，能夠一次性對大量的基因轉錄本進行分析。但是，在組成復雜的細胞混合物中，盡管***表達的基因可以被識別出來，但來自于少數細胞群體（例如干細胞）的轉錄本卻很可能會被掩蓋掉，尤其是在每個細胞中以低豐度形式出現的轉錄本。為了解決這個問題，單細胞檢測技術應用而生，而且逐漸受到了越來越多的重視。ddPCR在單細胞分析中的優勢在于它不需要標準曲線就能進行***定量。而且，由于能夠以非常高的敏感性區分至少五種不同的基因轉錄本，因此無需進行其他方法所要求的單細胞cDNA預擴增，這可以消除預擴增和NGS文庫準備中潛在的轉錄本定量失真，能夠能加真實的反映單細胞群體中關鍵基因的特征。天津Digital PCR數字PCR服務