無細胞蛋白表達技術(shù)（CFPS）根據(jù)反應(yīng)體系的設(shè)計可分為分批式（Batch）、雙層式（Bilayer）和連續(xù)交換式（CECF）三種主要形式。分批式是Zui基礎(chǔ)的形式，反應(yīng)在單一試管中進行，操作簡單但受限于底物耗盡和副產(chǎn)物積累，表達時間通常只4小時，適合小規(guī)模篩選（如Promega的試劑盒）。雙層式通過密度差異將反應(yīng)液與緩沖液分層，延長反應(yīng)時間至8-20小時，日本CFS公司的產(chǎn)品采用此設(shè)計。連續(xù)交換式（CECF）通過半透膜連接反應(yīng)室與供應(yīng)室，持續(xù)補充底物并移除副產(chǎn)物，可將反應(yīng)延長至24小時，產(chǎn)量明顯提高（如德國RTS系統(tǒng)的1mL及以上規(guī)模產(chǎn)品）兔網(wǎng)織紅細胞裂解物??含??成熟血紅蛋白合成機制??，能實現(xiàn)復(fù)雜酶活性分子的功能性蛋白表達。分泌蛋白表達原理

從實驗室走向產(chǎn)業(yè)化，無細胞蛋白表達技術(shù)還面臨多重障礙。規(guī)模化生產(chǎn)時，反應(yīng)體系的均一性和重復(fù)性難以保證，且大規(guī)模制備高活性裂解物的成本效益比仍需優(yōu)化。在下游純化環(huán)節(jié)，由于反應(yīng)混合物中含有大量核酸、酶和其他細胞組分，目標蛋白的分離純化步驟比傳統(tǒng)方法更復(fù)雜。此外，目前大多數(shù)CFPS工藝仍處于分批反應(yīng)模式，連續(xù)化生產(chǎn)設(shè)備的開發(fā)滯后，限制了其在工業(yè)流水線中的應(yīng)用潛力。盡管存在這些挑戰(zhàn)，隨著微流控技術(shù)、人工智能優(yōu)化反應(yīng)條件等新方法的引入，CFPS技術(shù)正在逐步突破這些產(chǎn)業(yè)化瓶頸。分泌蛋白表達行業(yè)動態(tài)CHO細胞重組蛋白表達??是生產(chǎn)抗體的常用技術(shù)。

在合成生物學中，無細胞蛋白表達技術(shù)是構(gòu)建人工細胞和基因電路的he xin工具。研究人員通過混合不同物種（如大腸桿菌+哺乳動物）的裂解物，創(chuàng)建雜合翻譯系統(tǒng)，以實現(xiàn)跨物種蛋白的協(xié)同合成。該技術(shù)還支持無細胞基因線路的快速原型設(shè)計，例如將CRISPR組分與報告蛋白共表達，用于體外診斷工具的開發(fā)。由于擺脫了細胞膜的限制，CFPS可直接整合非生物元件（如合成聚合物或納米材料），推動人工合成生命和生物-非生物雜合系統(tǒng)的前沿研究。無細胞蛋白表達技術(shù)可快速表達膜蛋白（如GPCRs、離子通道）用于藥物靶點研究，解決了此類蛋白在細胞內(nèi)難表達、易沉淀的問題。在診斷領(lǐng)域，基于CFPS的體外轉(zhuǎn)錄-翻譯系統(tǒng)被整合到便攜式設(shè)備中，用于現(xiàn)場檢測病原體核酸（如埃博拉病毒），實現(xiàn)“樣本進-結(jié)果出”的快速診斷。此外，該技術(shù)還能合成定制化抗原，用于抗體庫篩選或個性化cancer疫苗開發(fā)。

從裂解物來源看，無細胞蛋白表達技術(shù)主要分為原核系統(tǒng)和真核系統(tǒng)。原核系統(tǒng)以大腸桿菌S30提取物為主，成本低、耐受性強，適合表達簡單蛋白或引入非天然氨基酸，但缺乏復(fù)雜翻譯后修飾能力。真核系統(tǒng)包括兔網(wǎng)織紅細胞裂解物（RRL）和麥胚提取物（WGE），前者適合哺乳動物蛋白的高效表達，后者對植物和病毒蛋白更優(yōu)，且能處理長鏈RNA，但成本較高。此外，昆蟲細胞提取物系統(tǒng)近年也用于復(fù)雜蛋白的修飾研究。英國nuclera 高通量微流控蛋白表達篩選系統(tǒng)可助力支持無細胞蛋白表達技術(shù)，如想了解更多信息，歡迎咨詢官方代理商上海曼博生物！通過體外蛋白表達，只需在裂解物中添加對應(yīng)mRNA，就能在裂解物中安全實現(xiàn)dusu合成及機制研究。

體外蛋白表達系統(tǒng)的明顯缺陷在于 缺乏真核細胞器結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致關(guān)鍵翻譯后修飾難以實現(xiàn)：糖基化不完整性： 裂解物中缺乏高爾基體轉(zhuǎn)運機制，只能生成高甘露糖型等簡單糖鏈，無法合成復(fù)雜雙觸角N-糖；磷酸化/乙酰化失衡： 激酶/磷酸酶網(wǎng)絡(luò)不完整，使信號通路蛋白的修飾狀態(tài)與生理條件差異明顯；二硫鍵錯配風險： 氧化還原環(huán)境調(diào)控不足導(dǎo)致多二硫鍵蛋白錯誤折疊率升高。這些局限使體外蛋白表達在 zhi liao性抗體等需精確修飾的蛋白生產(chǎn)中應(yīng)用受限。PCR純化后的線性DNA模板可直接用于??大腸桿菌體外蛋白表達??。293t蛋白表達難點

添加納米盤磷脂的 ?GPCR體外蛋白表達??系統(tǒng)，功能性受體得率提升至80%。分泌蛋白表達原理

相較于原核表達體系，真核體外蛋白表達的he xin優(yōu)勢在于具備部分翻譯后修飾能力，但 關(guān)鍵修飾途徑仍存在明顯局限。在缺乏內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體轉(zhuǎn)運機制的情況下，糖基化修飾通常終止于高甘露糖型（Man?GlcNAc?）階段，無法合成復(fù)雜雙觸角唾液酸化糖鏈。這一缺陷直接影響zhi liao性抗體的抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性（ADCC）效應(yīng)。同時，裂解物中二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）與分子伴侶（如BiP）的活性不足，導(dǎo)致含多對二硫鍵的蛋白錯誤折疊率升高40%-60%。為克服此瓶頸，需在裂解物中外源性添加重組糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體（如GnT-I/GnT-II/FUT8）以重構(gòu)修飾途徑，并通過優(yōu)化氧化還原電勢（Eh=-230 mV至-280 mV）改善二硫鍵形成效率。體外蛋白表達的這些修飾缺陷是目前制約其應(yīng)用于功能性糖蛋白生產(chǎn)的主要因素。分泌蛋白表達原理