傳統微生物發酵生產工業酶面臨周期長（>72 小時）且純化復雜的瓶頸。新一代連續流體外蛋白表達系統 通過耦合反應器實現高效合成：將大腸桿菌裂解物與纖維素酶基因模板泵入螺旋管，在 30℃ 恒溫條件下持續產出酶蛋白，每小時產量達 120 mg/L，較批次反應提高 8 倍。德國 BRAIN AG 公司利用此技術生產 耐熱木聚糖酶，直接添加至造紙漿料中降解半纖維素，使漂白劑用量減少 30%。該系統還支持 實時補料——補充消耗的氨基酸和能量物質可維持 48 小時穩定表達，單位酶成本降至 $2.5/g，逼近發酵法經濟閾值。自供能體外蛋白表達??系統是構建人工細胞的重要路徑。GPCR蛋白表達產業鏈

無細胞蛋白表達技術在藥物研發領域具有明顯優勢，尤其適用于快速生產zhi liao性蛋白、抗體和疫苗抗原。例如，在COVID-19期間，研究人員利用CFPS在幾小時內合成COVID-19刺突蛋白的RBD結構域，大幅加速了疫苗候選分子的篩選和驗證。此外，該技術可高效表達傳統細胞系統難以生產的毒性蛋白（如某些抗ai藥物靶點）或易降解蛋白（如細胞因子），并支持非天然氨基酸插入，為抗體藥物偶聯物（ADCs）的開發提供準確修飾平臺。相比哺乳動物細胞培養（通常需要1-2周），CFPS可在24小時內完成從基因到蛋白的全流程，明顯縮短藥物發現周期。目的蛋白表達行業動態大腸桿菌體外蛋白表達的單次反應成本（$1.5）只為哺乳細胞系統的 1/50。

在小規模、快速驗證性實驗中，無細胞蛋白表達技術（CFPS）的性價比優勢明顯。其單次反應成本約200-500元（含商業化裂解物和模板），雖高于大腸桿菌發酵的試劑成本，但可節省大量時間——傳統細胞表達需3-5天（含轉化、培養、誘導），而CFPS只需4-8小時即可獲得ug-mg級蛋白，尤其適合藥物篩選、突變體庫構建等時效性需求。例如，某CRO公司采用CFPS一周內完成50種抗體變體的活性測試，而傳統方法只能完成5-10種，人力與設備成本大幅降低。

相較于原核表達體系，真核體外蛋白表達的he xin優勢在于具備部分翻譯后修飾能力，但 關鍵修飾途徑仍存在明顯局限。在缺乏內質網-高爾基體轉運機制的情況下，糖基化修飾通常終止于高甘露糖型（Man?GlcNAc?）階段，無法合成復雜雙觸角唾液酸化糖鏈。這一缺陷直接影響zhi liao性抗體的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）效應。同時，裂解物中二硫鍵異構酶（PDI）與分子伴侶（如BiP）的活性不足，導致含多對二硫鍵的蛋白錯誤折疊率升高40%-60%。為克服此瓶頸，需在裂解物中外源性添加重組糖基轉移酶復合體（如GnT-I/GnT-II/FUT8）以重構修飾途徑，并通過優化氧化還原電勢（Eh=-230 mV至-280 mV）改善二硫鍵形成效率。體外蛋白表達的這些修飾缺陷是目前制約其應用于功能性糖蛋白生產的主要因素。通過微型化??體外蛋白表達??系統，24小時內測試了50種激酶抑制劑的效價。

無細胞蛋白表達技術（CFPS）雖然具有快速、靈活等優勢，但仍存在一些關鍵缺點。首先，成本較高，商業化裂解物、能量試劑和酶的價格昂貴，小規模實驗單次反應成本可達數百元，大規模生產的經濟性尚未完全解決。其次，蛋白產量較低，反應通常在幾小時內終止，產量（0.1-1 mg/mL）遠低于細胞表達系統（如大腸桿菌可達10 mg/mL以上）。此外，復雜蛋白表達受限，原核裂解物缺乏真核翻譯后修飾能力（如糖基化），而真核裂解物成本更高；部分蛋白可能因折疊不完全而喪失活性。技術操作上，反應條件（pH、離子強度等）需精細調控，且線性DNA模板易降解，增加了實驗難度。CFPS目前更適合小規模應用，在超長蛋白（>100 kDa）表達和工業化連續生產方面仍面臨挑戰。未來需通過開發低成本試劑、優化能量再生系統和自動化工藝來突破這些瓶頸。CHO細胞重組蛋白表達??是生產抗體的常用技術。293f細胞蛋白表達載體構建

大腸桿菌裂解物的??高翻譯效率??可支持??100μg/mL級??蛋白產量，但缺乏糖基化修飾能力。GPCR蛋白表達產業鏈

無細胞蛋白表達技術的模板可以是線性DNA（如PCR產物）或環狀質粒，需包含啟動子（如T7/T3/SP6）和核糖體結合位點（RBS）以啟動轉錄翻譯。為提升效率，系統可能添加分子伴侶（如DnaK/GroEL）輔助蛋白折疊，或氧化還原劑（如谷胱甘肽）促進二硫鍵形成。部分高級系統（如PURE體系）使用純化重組元件替代粗提物，實現更高可控性，但成本較高。無細胞蛋白表達技術可靈活引入非天然氨基酸（nnAA），擴展了蛋白質的功能多樣性。例如，通過定制tRNA和氨酰-tRNA合成酶，無細胞蛋白表達技術系統能準確將熒光標記或交聯基團嵌入目標蛋白，用于結構生物學或藥物偶聯開發。更前沿的應用是人工生命體系的構建，如利用無細胞蛋白表達技術合成噬菌體或人工細胞雛形，結合微流控技術模擬細胞內代謝網絡，為合成生物學研究提供可控的簡化模型。GPCR蛋白表達產業鏈