Umibio 產品：UR52121 /UR52120 外泌體提取純化試劑盒（細胞上清）

Q：如何增加外泌體試劑盒的提取效率？

A：首先，樣品準備階段確保樣品的質量和數量充足；在提取階段，加入ECS試劑后可以通過增加靜置時間來提高提取效率，但同時也可能影響到純度，因此靜置時間也需要適當控制，初次實驗可以考慮靜置過夜。

Q：離心后無法看到沉淀如何處理？

A：樣品中的外泌體是微量的存在，離心后無法看到沉淀屬于正常現象。建議離心后用PBS重懸沉淀時不僅洗脫肉眼可見的沉淀部位，還要吹洗離心管外側靠近底部的狹長區域，具體位置根據離心機傾斜角度決定。建議在下次樣品準備階段確保樣品的質量和數量充足，干細胞/原代細胞上清可在提取前采用超濾管（100KD）濃縮3~5倍后再提取。

Q：使用EPF柱時堵塞如何處理？

A：過濾柱的孔徑在220nm左右。如果出現堵塞情況，可以將柱子旋轉180度再次離心。若上室還有殘留液體，需要使用新的EPF柱，該柱子可以單獨購買（產品貨號UR90102）。

Q：沉淀法的具體原理是什么？

A：將高親水性聚合物（聚乙二醇等）添加到含外泌體的溶液中后，外泌體周圍的水分子被聚合物束縛，降低了外泌體的溶解度并誘導其隨后的沉淀，使外泌體在低速離心下可以很容易沉淀。

Q：開封后的ECS試劑有沉淀出現是否可以繼續使用？

A：沉淀物如果是結晶狀，建議56度水浴搖晃混勻。如果結晶消失，則可以繼續使用，少量沉淀不影響提取效果。

Umibio 產品：UR52146/UR52149外泌體提取試劑盒（乳液）

Q：乳液提取試劑盒加solution B之后無豆花狀固體，此時是否可以繼續實驗？

A：不可以，必須在明確看到豆花狀沉淀，溶液變透明后才可進行下一步操作。此時需要繼續加入適量solution B，并在37度水浴加熱，直至看到豆花狀沉淀。

Umibio 產品：UR52151/UR52150外泌體提取純化試劑盒（血液）升級版

Q：試劑盒UR52151與UR52136有哪些不同？

A：試劑盒UR52151相較UR52136增加了去雜蛋白環節，提升了外泌體的純度，相應得率會有所下降。血清樣品蛋白含量很高，沉淀法試劑盒無法實現完全分離（兩款均是），不建議做外泌體陰性蛋白（如calnexin）檢測。

Q：如何選擇血清和血漿樣本來進行外泌體研究？

A：血清和血漿都是常見的外泌體樣本來源。由于血液在凝血過程中血小板會受到刺激會產生大量外泌體，因此若需要排除血小板外泌體的影響應采用血漿進行外泌體提取檢測。

Q：出現溶血現象的血清/血漿樣本對外泌體提取有什么影響？

A：破碎的細胞會釋放一些雜質影響下游實驗，尤其是電鏡鑒定。溶血樣品里的外泌體也會降解。溶血樣品不建議用于外泌體提取。

Q：試劑盒可以提取多少血清/血漿樣本的外泌體？

A：該試劑盒一共可以提取20個樣本的外泌體，每個樣本最大體積為1mL。建議使用0.5mL體系進行實驗，在EPF柱純化外泌體階段再進行樣本合并。

Umibio 產品：UR52161/UR52160外泌體提取純化試劑盒（組織）

Q：組織提取試劑盒如何提高得率？

A：加入solutionA2后可以增加消化時間，不超過1小時；加入solutionB2后可以增加靜置時間，不超過1小時。

Umibio 產品：UR52301 外泌體 CD63&TSG101蛋白檢測試劑盒

Q：Western Blot報告中PC條帶是何種蛋白？

A：PC是系統樣品，用于指示本次Western Blot檢測系統是否正常工作。如果PC有條帶，目的樣品無條帶，說明目的樣品的目的蛋白豐度很低；如果PC也無條帶，則說明本次實驗體系存在問題。

Q：外泌體蛋白質標記物為何會有兩條條帶？

A：在不同的樣品中檢測到的蛋白條帶大小和帶數存在差異是正常現象。膜蛋白由于修飾剪切等緣故，可能會出現多條帶的狀況；不同細胞中修飾剪切等情況不一定相同，因此相同蛋白在不同樣品中檢出的條帶表現可能不同屬于正常情況。

Q：CD63是一個多次跨膜蛋白，煮樣可能導致蛋白聚集，應該如何判斷是否煮樣？

A：建議CD63進行煮樣，溫度控制在70度，時間為10min。

Umibio 產品：UR52302/UR52303 外泌體紅色熒光標記染料（PKH26/PKH67）

1、建議用于染料標記的外泌體原始濃度達到0.5~1μg/μL。外泌體濃度過低實驗失敗風險較高。

2、外泌體染色步驟中去除游離染料的第4、5步必不可少，以避免游離染料對后期實驗的干擾。這一步相當于重新提取外泌體，所有外泌體提取純化方式都適用。

3、去除游離染料的方法推薦選擇3~10KD的超濾管，利用其置換溶劑功能去除游離染料。具體步驟和實驗參數請咨詢超濾管廠商。

4、染料標記外泌體與細胞共孵育的培養條件盡可能使用無血清培養基，以提高細胞對染料標記外泌體的攝取效率，共孵育參考時長為2小時。

5、本染料也可用于細胞膜染色，參考劑量染料濃度為2X10–6 M，細胞濃度為1X107 cells/mL。

6、基于以下兩個原因，建議準備2倍于正常共孵育實驗所需外泌體的量來進行染料標記。一是使用過量染料進行標記，外泌體的染色效率仍無法達到100%；二是去除游離染料的過程中存在外泌體回收率的損失。

Umibio 產品：UR21017 外泌體熒光染料（DIR）

1、活體成像對外泌體濃度要求較高，建議用于染料標記的外泌體原始濃度達到0.5~1.5μg/μL，外泌體濃度過低實驗失敗風險較高。

2、外泌體染色步驟中去除游離染料的第4、5步必不可少，以避免游離染料對后期實驗的干擾。這一步相當于重新提取外泌體，所有外泌體提取純化方式都適用。

3、去除游離染料的方法推薦選擇3~10KD的超濾管，利用其置換溶劑功能去除游離染料。具體步驟和實驗參數請咨詢超濾管廠商。

4、DiR碘化物（DiR染料）的發射波長肉眼不可見，需要使用配備CCD鏡頭或其他設備的近紅外檢測儀器，建議使用活體成像儀。

5、建議染料標記的外泌體在注射后24h內設置梯度時間進行觀測，多數情況注射后2-8小時熒光強度達到峰值。為保證觀察結果，小動物需要做剃毛處理。

6、基于以下兩個原因，建議準備2倍于正常活體成像和示蹤實驗所需外泌體的量來進行染料標記。一是使用過量染料進行標記，外泌體的染色效率仍無法達到100%；二是去除游離染料的過程中存在外泌體回收率的損失。

Umibio 產品：UR32061 miRNA 加尾法逆轉錄試劑盒

Q：外泌體miRNA qPCR實驗選用哪個基因做內參？

A：外泌體qPCR目前沒有公認內參基因，本公司檢測miRNA做的是外參。外參可以最大限度降低對定量實驗造成的干擾，適用于內參表達不穩定的外泌體或暫未發現合適內參的其他樣品，對目的microRNA進行相對定量，替代內參作用。部分文獻也會選取U6等作為內參，可以參考對應文章。

Umibio產品：UR32071/UR32070 /UR32081/UR32080 2×SYBR Green qPCR 試劑（預混 ROX1型&預混 ROX2 型）

Q：下游qPCR檢測時CT值過高如何處理？

A：外泌體RNA是微量的存在，首先樣品準備階段確保樣品的質量和數量充足（例如血清建議新鮮樣本準備2ml以上）。有實驗表明，2ml血清樣本提取的外泌體，qPCR檢測U6（細胞樣本microRNA內參）的CT值只有30+，目標基因CT值在30+~40+。CT值通常qPCR結果在30以上默認為不表達，但外泌體比較特殊，可適當放寬標準。

Q：外泌體qPCR實驗如何使用內參？

A：外泌體沒有公認內參，常規內參基因在外泌體中表達量甚至可能比目標基因還低。外參是在沒有合適內參的情況下的替代物。microRNA 檢測外參是化學合成的線蟲短片段單鏈 RNA (cel-miR-39-3p) mimics，經檢測在人類、小鼠、大鼠中均無同源片段，最大限度降低了對定量實驗造成的干擾，適用于內參表達不穩定的外泌體或暫未發現合適內參的其他樣品，對目的 microRNA 進行相對定量。

外參序列：ucaccggguguaaaucagcuug；

cel-miR-39-3p 外參正序列：AACACGCTCACCGGGTGTAA。

Q：國產儀器應該選擇哪款qPCR試劑盒？

A：多數國產儀器可以不用ROX校準，所以推薦用低濃度的ROX2試劑盒。具體型號可以咨詢我司。

Umibio 產品：UR21021 外泌體 GW4869抑制劑

Q：M指的是什么單位？

A：M指的是體積摩爾濃度，mol/L。

Q：GW4869的溶劑是什么？

A：DMSO。

Umibio 產品：UR51102/ UR51101 外泌體專用培養基

Q：外泌體專用培養基是否可用于重懸、接種以及繼續培養細胞？

A：不可以。外泌體專用培養基不含促細胞貼壁的因子，可以維持已貼壁的細胞一定時間內的生長，無法替代完全培養基長期培養細胞。

Q：外泌體專用培養基有哪些成分？

A：產品含有 HEPES，L-Glutamine, Pharm Grade Albumin, Hypoxanthine, Thymidine, Phenol Red, Glucose（偏低糖2g/L）. 無動物源Xeno-free, Serum-free.不含生長因子（Growth factors），細胞培養過程中無需添加血清即可達到完全培養基的培養狀態。

Umibio 產品：UR51121/UR51120 外泌體專用間充質干細胞培養基

Q：干細胞在更換外泌體專用間充質干細胞培養基的過程中，遇到干細胞生長緩慢，甚至死亡的現象，該如何處理？

A：干細胞在更換培養基的過程中，對于培養環境比較敏感，尤其是從高營養環境（血清/HPL添加培養基）更換到低營養環境（化學成分確定培養基）的過程中會遇到干細胞生長緩慢，甚至死亡的現象，這些都是更換培養體系過程中經常遇到的問題。

解決方案1：提高更換培養基時干細胞的融合度。細胞融合度從說明書中20%提高到50%-60%時，然后更換外泌體專用間充質干細胞培養基，然后在細胞融合度70%-80%以上時收集細胞上清液。

解決方案2：采用的是培養基逐步替換的方法。逐步減少原干細胞培養基的用量和逐步增加外泌體專用間充質干細胞培養基的用量，在干細胞融合度20%時，吸取一半的原始培養基，加入一半的外泌體專用間充質干細胞培養基，細胞培養24小時后，再替換為完全的外泌體專用間充質干細胞培養基的進行培養。

Umibio 產品：UR52031/UR51032/UR51039LipoP30轉染試劑

Q：lipo30進行siRNA的轉染步驟有無特殊要求？

A：在共轉染混合物中添增強劑是為了促進質粒DNA的轉染，它對siRNA的轉染沒有效果，因此在單獨進行siRNA轉染時無需在轉染混合物中添加（即第2步在稀釋 siRNA 時不要加入LipoP30-A試劑）。

Q：lipo30進行不同種類核酸轉染時有何不同要求？

A：對于未經修飾的siRNA、Silencer siRNA、Stealth RNAi siRNA、Silencer Select siRNA、Ambion Pre-miR前體、mirVana miRNA 模擬物、Ambion Anti-miR 抑制劑與mirVana miRNA抑制劑而言，只需使用B試劑即可有效遞送至胞漿。此時無需使用A試劑。

對于質粒DNA、基于載體的BLOCK-iT shRNA或miRNA、ViraPower HiPerform慢病毒表達載體，或GeneArt CRISPR核酸酶載體而言，B試劑需與A試劑聯用以確保高效的細胞核遞送效果。