跟其他類(lèi)型的核酸酶一樣,SAN HQ高鹽核酸酶和M-SAN HQ中鹽核酸酶的滅活方法有很多,分為可逆滅活及不可逆滅活。金屬離子螯合劑如EDTA會(huì)可逆抑制兩者的活性,加入的EDTA濃度一般是溶液中Mg2+濃度的2倍左右即可完全抑制活性;后續(xù)補(bǔ)加過(guò)量的Mg2+即可恢復(fù)核酸酶活性。加熱、還原劑(如DTT)、咪唑、甘油及表面活性劑(如高于15%濃度的Triton X-100、SDS、尿素等)等都可以使其不可逆失活。在生物工藝流程,需要結(jié)合上下游應(yīng)用需要選擇合適的方法去除或滅活核酸酶。相比傳統(tǒng)的全能核酸酶,M-SAN HQ中鹽核酸酶在生理鹽條件下,對(duì)HCD的去除效率更高。舟山70950-160中鹽核酸酶報(bào)價(jià)表
一般來(lái)說(shuō),生物生產(chǎn)工藝用的核酸酶以BenzonaseTM(BenzonaseTM是Merck的注冊(cè)商標(biāo))為主,能高效降解任何形式(雙鏈、單鏈、線狀、環(huán)狀)的DNA和RNA。該酶來(lái)自于大自然界普遍存在的S.Marcescen,通過(guò)E.coli發(fā)酵生產(chǎn)得到。該酶的適宜反應(yīng)條件是低鹽濃度范圍(<100mM鹽濃度),且酶活隨著鹽濃度上升而下降,在300mM鹽濃度時(shí)酶活幾乎喪失。對(duì)于細(xì)胞基因藥物常用的兩種病毒載體LV和AAV,LV由于含有脂包膜結(jié)構(gòu)一般都在生理鹽條件下存在,而AAV在高鹽條件下不易團(tuán)聚、更穩(wěn)定。而在生理鹽濃度及更高濃度條件下,Benzonase活性受到抑制。安徽70960-001中鹽核酸酶供應(yīng)商ArcticZymes精于規(guī)?;a(chǎn)獨(dú)特特性的酶產(chǎn)品,于2005年在證券交易所上市。
ArcticZymes Technologies產(chǎn)品大都來(lái)源于深海microbes中,具有一些共同的特性。1. 熱不穩(wěn)定性,使酶產(chǎn)品相對(duì)容易失活,簡(jiǎn)化工作流程,方便自動(dòng)化過(guò)程;2. 低溫活性,即在低溫或常溫下具有更高活性,縮短酶與底物的孵育時(shí)間,提高反應(yīng)速度及效率;3. 耐鹽特性,是指大部分酶產(chǎn)品能耐受較高的鹽濃度,拓寬反應(yīng)體系范圍選擇,在特殊體系的應(yīng)用場(chǎng)景下具有更為出色的性能表現(xiàn);4. 獨(dú)特特性,極限酶類(lèi)產(chǎn)品能夠在非常規(guī)條件下進(jìn)行酶促反應(yīng),讓一些反應(yīng)從不可能變?yōu)榭赡堋?/p>
慢病毒載體既可以轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂細(xì)胞也可以轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細(xì)胞,被認(rèn)為是安全的,并且可以提供長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)基因表達(dá),是目前較通用的基因轉(zhuǎn)移方法之一。因慢病毒載體能有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞,如造血干細(xì)胞和T細(xì)胞,在細(xì)胞和基因藥物中的應(yīng)用越來(lái)越guang泛。源自人類(lèi)胚胎腎細(xì)胞的HEK293細(xì)胞系是成熟的生產(chǎn)LV的系統(tǒng),因?yàn)樗鼈兎浅_m合懸浮培養(yǎng)并且易于轉(zhuǎn)染。在無(wú)血清培養(yǎng)基中的懸浮培養(yǎng)在大規(guī)模生產(chǎn)中具有優(yōu)勢(shì),因?yàn)樗伺沃g的差異并降低了不定因子污染的風(fēng)險(xiǎn)。M-SAN HQ中鹽核酸酶在細(xì)胞培養(yǎng)鹽濃度下具有較高活性,縮短酶切時(shí)間、得到更短DNA片段;
通過(guò)三質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)體系生產(chǎn)病毒載體,會(huì)引入宿主細(xì)胞DNA殘留(HCD)、蛋白殘留(HCP)、工藝雜質(zhì)(如antibiotics、核酸酶等外源物質(zhì))等污染,存在潛在的致瘤性和免疫原性等風(fēng)險(xiǎn)。藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)一般允許生物制品中存在10ng/dose以下的殘留DNA。此外,根據(jù)雜質(zhì)來(lái)源、工藝以及產(chǎn)品類(lèi)型不同,也會(huì)對(duì)HCD限度做不同要求。為了達(dá)到這個(gè)要求,一般通過(guò)核酸酶處理和色譜聯(lián)用的方法。一般在細(xì)胞培養(yǎng)液裂解/收獲、澄清收獲及超濾濃縮等環(huán)節(jié)加入核酸酶處理,需要工藝摸索來(lái)確認(rèn)處理方式。Medium-Salt Active Nuclease High Quality (M-SAN HQ),中文名稱(chēng)中鹽核酸酶。揚(yáng)州M-SAN HQ中鹽核酸酶聯(lián)系方式
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ArcticZymes Technologies提供獨(dú)特特性的鹽活性核酸酶(Salt Active Nucleases,SANs)系列產(chǎn)品,主要包含SAN HQ高鹽核酸酶和M-SAN HQ中鹽核酸酶。這兩款酶都是非特異核酸內(nèi)切酶,跟Benzonase一樣能高效降解任何形式(雙鏈、單鏈、線狀、環(huán)狀)的DNA和RNA;都來(lái)自于深海microbes,通過(guò)Pichia pastoris發(fā)酵生產(chǎn)得到。這兩款酶的區(qū)別在于發(fā)揮酶活的適宜鹽濃度不同,——M-SAN HQ中鹽核酸酶的適宜鹽濃度在175mM-250mM,而SAN HQ高鹽核酸酶的適宜鹽濃度在400mM-600mM。舟山70950-160中鹽核酸酶報(bào)價(jià)表