實施例3、實施例1制備的試劑盒的準(zhǔn)確性驗證1、取1ng標(biāo)準(zhǔn)品2800m、樣本一、樣本二或樣本三(見實施例2中步驟二)，按照yfilerpluspcramplifcationkit(thermofisherscientific)的說明書步驟進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測，得到各個基因座的等位基因基因型。分型結(jié)果見表4。表4注：m為毛細(xì)管電泳檢測技術(shù)的分型結(jié)果，e為二代測序技術(shù)的分型結(jié)果。2、按照實施例2中步驟一的方法檢測標(biāo)準(zhǔn)品2800m、樣本一、樣本二或樣本三，得到各個基因座的等位基因基因型。分型結(jié)果見表4。結(jié)果表明，實施例1制備的試劑盒與yfilerpluspcramplifcationkit重合的基因座，在標(biāo)準(zhǔn)品2800m、樣本一、樣本二和樣本三中的分型結(jié)果完全一致。實施例4、實施例1制備的試劑盒中引物具有不可替換性實施例1制備的試劑盒是本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過大量實驗獲得的，主要包括擴(kuò)增各個基因座引物的反復(fù)調(diào)試和引物濃度的摸索。由于復(fù)合的基因座數(shù)目較多，引物間相互抑制情況復(fù)雜，所以試劑盒中用于擴(kuò)增各個基因座的引物不可替換。1、設(shè)計并合成表5中第2列所示的、用于擴(kuò)增65個str基因座的引物，然后混合，獲得引物混合物1。設(shè)計并合成表5中第4列所示的、用于擴(kuò)增66個str基因座的引物，然后混合，獲得引物混合物2。【邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)】一直以來致力于轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)服務(wù)和伴隨診斷產(chǎn)品開發(fā)及商業(yè)化。湖南多基因聯(lián)合檢測邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺值得推薦

    套峰細(xì)分的話有如下幾種情形:全雙峰：如樣品為克隆后質(zhì)粒，則質(zhì)粒中含有多個引物結(jié)合位點；如樣品為PCR產(chǎn)物，則含有非特異性擴(kuò)增。前端雙峰：如樣品為克隆后質(zhì)粒，則其含有多個引物結(jié)合位點，并且其中一套模板出現(xiàn)測序中斷的現(xiàn)象；如樣品為PCR產(chǎn)物，則PCR產(chǎn)物中含有多個引物結(jié)合位點，或者PCR產(chǎn)物中含有引物二聚體等小片段污染。中間雙峰：如樣品為克隆后質(zhì)粒，則質(zhì)粒并非單克隆；如樣品為PCR產(chǎn)物，則部分產(chǎn)物中具有堿基缺失現(xiàn)象，或目的基因為等位基因?qū)е翽CR產(chǎn)物自身不純。后端雙峰：如樣品為克隆后質(zhì)粒，則質(zhì)粒并非單克隆；如樣品為PCR產(chǎn)物，則部分產(chǎn)物中具有堿基缺失現(xiàn)象。解決辦法：針對二聚體及小片段干擾的情況，可以使用切膠回收的方法純化PCR產(chǎn)物；針對含有多個引物結(jié)合位點的情況，應(yīng)當(dāng)更換測序引物；針對PCR產(chǎn)物出現(xiàn)堿基缺失的情況，可以使用克隆后測序以排除堿基缺失的產(chǎn)物；針對非單克隆的情況，應(yīng)在確認(rèn)克隆無誤的前提下重新挑取單克隆進(jìn)行測序；針對PCR產(chǎn)物含有非特異性擴(kuò)增的情況，應(yīng)優(yōu)化PCR反應(yīng)條件去除非特異性擴(kuò)增，重新制備樣品測序；針對等位基因具有雙模板的情況，應(yīng)當(dāng)采用克隆測序以保證單次測序樣品序列一致。 遼寧多靶點邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺口碑推薦邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)目前已完成約30+靶點的方法學(xué)驗證，50+靶點的方法學(xué)建立。

    1、Illumina原理：橋式PCR+4色熒光可逆終止+激光掃描成像主要步驟：①DNA文庫制備——超聲打斷加接頭②Flowcell——吸附流動DN**段③橋式PCR擴(kuò)增與變性——放大信號④測序——測序堿基轉(zhuǎn)化為光學(xué)信號優(yōu)勢劣勢：Illumina的這種測序技術(shù)每次只添加一個dNTP的特點能夠很好的地解決同聚物長度的準(zhǔn)確測量問題，它的主要測序錯誤來源是堿基的替換。而讀長短（200bp-500bp）也讓其應(yīng)用有所局限。2、Roche454油包水PCR+4種dNTP車輪大戰(zhàn)+檢測焦磷酸水解發(fā)光主要步驟：①DNA文庫制備——噴霧打斷加接頭②乳液PCR——注水入油**PCR③焦磷酸測序——磁珠入孔，焦磷酸信號轉(zhuǎn)化為光學(xué)信號優(yōu)勢劣勢：454技術(shù)優(yōu)勢測序讀長較長，平均可達(dá)400bp，缺點是無法準(zhǔn)確測量類似于PolyA的情況時，測序反應(yīng)會一次加入多個T，可能導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。也正是由于這一原因，454技術(shù)會在測序過程中引入插入和缺失的測序錯誤。3、IonTorrent原理油包水PCR+4種dNTP車輪大戰(zhàn)+微電極PH檢測主要步驟：①DNA文庫制備——噴霧打斷加接頭②乳液PCR——注水入油**PCR③微電極pH檢測——磁珠入池記錄pH優(yōu)勢劣勢：IonTorrent與454相比，主要差異在測序中，IonTorrent不需要昂貴的物理成像設(shè)備，成本相對較低體積較小。

    第三代測序技術(shù)以PacBio公司的SMRT技術(shù)和OxfordNanoporeTechnologies公司的納米孔單分子技術(shù)為**的新一代測序技術(shù)被稱為第三代測序技術(shù)，與前兩代測序技術(shù)相比，其比較大的特點就是單分子測序，測序過程無需進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并且理論上可以測定無限長度的核酸序列。PacBio技術(shù)平臺SMRT芯片是一種帶有很多ZMW孔的厚度為100nm的金屬片，將DNA聚合酶、待測序列和不同熒光標(biāo)記的dNTP放入ZMW孔的底部。熒光標(biāo)記的位置是磷酸基團(tuán)，當(dāng)一個dNTP被添加到合成鏈上的同時，它會進(jìn)入ZMW孔的熒光信號檢測區(qū)，根據(jù)熒光的種類就可以判定dNTP的種類，從而獲得核酸的堿基序列信息。ZMW孔PacBio平臺測序原理每個ZWM孔只允許一條DNA模板進(jìn)入，DNA模板進(jìn)入后，DNA聚合酶與模板結(jié)合，加入4種不同顏色熒光標(biāo)記4種dNTP，其通過布朗運動隨機進(jìn)入檢測區(qū)域并與聚合酶結(jié)合從而延伸模板，與模板匹配的堿基生成化學(xué)鍵的時間遠(yuǎn)遠(yuǎn)長于其他堿基停留的時間，因此統(tǒng)計熒光信號存在時間的長短，可區(qū)分匹配的堿基與游離堿基。通過統(tǒng)計4種熒光信號與時間的關(guān)系，即可測定DNA模板序列。 邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)為生物標(biāo)志物研究和伴隨診斷開發(fā)提供科學(xué)支持，多層面助力新藥研發(fā)臨床試驗。

    下游的引物IP用于第二輪多重PCR。具體的建庫過程是：步驟1，將樣本DNA進(jìn)行片段化處理，隨后每個片段兩端加上特殊的接頭；步驟2，加入***輪擴(kuò)增的上游引物混合池，與特殊接頭互補的通用引物，配制成PCR總體系，進(jìn)行***輪擴(kuò)增；步驟3，將***輪PCR產(chǎn)物純化后，加入第二輪擴(kuò)增的下游引物混合池，與第二步中使用過的特殊接頭互補的通用引物配制成PCR總體系，進(jìn)行第二輪擴(kuò)增；步驟4，將第二輪PCR產(chǎn)物純化后，配置反應(yīng)總體系，進(jìn)行Q-PCR定量，稀釋到合適的濃度，即可用于二代測序。上述技術(shù)方案中，作為推薦，步驟2中，***輪特異性引物是普通的PCR擴(kuò)增引物，共20個左右的堿基，Tm值設(shè)定在60℃，序列根據(jù)目標(biāo)區(qū)域設(shè)計得到，多個引物混成一個OP引物池做為***輪PCR的上游引物。PCR總體系為：2倍PCRMix35uL，10umol/LP71uL，1umol/LOP1uL或OP2uL，DNA25uL。上述技術(shù)方案中，作為推薦，步驟3中，第二輪特異性引物是普通的PCR擴(kuò)增引物，在其5’端加上測序接頭5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’共80個左右的堿基，其中根據(jù)目標(biāo)區(qū)域設(shè)計得到的序列長度是20個堿基左右，Tm值設(shè)定在60℃，多個引物混成一個IP引物池做為第二輪PCR的上游引物。邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)致力于解決創(chuàng)新藥物的研發(fā)痛點及患者的用藥痛點，助力精z準(zhǔn)醫(yī)療！遼寧多靶點邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺口碑推薦

邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)希望能和創(chuàng)新型藥企共同探索創(chuàng)新生物標(biāo)志物的臨床應(yīng)用潛力。湖南多基因聯(lián)合檢測邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺值得推薦

    既節(jié)約時間又降低測序成本。目前，基于法庭科學(xué)領(lǐng)域運用**多的ngs系統(tǒng)為illumina公司的miseqfgxtm系統(tǒng)和thermofisher公司的iontorrentpgmtm系統(tǒng)，但針對以上平臺的二代測序商業(yè)化str分型試劑盒的研發(fā)尚處于起步階段，主要有powerseqautosystem(promega，madison，wi,usa)、forenseqtmdnasignatureprepkit(illumina，sandiego，ca，usa)和precisionidglobalfilerngsstrkit(termofisher，waltham，ma，usa)。但以上試劑盒涉及的y-str相對較少，三個試劑盒分別包含了1個y-str基因座、26個y-str基因座、2個y-str基因座。同時存在試劑盒價格昂貴，配套的數(shù)據(jù)分析軟件只能針對各自開發(fā)試劑盒，參數(shù)的設(shè)置相對固定，只能對固有基因座的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，不利于法醫(yī)學(xué)實際應(yīng)用。因此，構(gòu)建一種適用于當(dāng)前主流二代測序檢測平臺miseqfgxtm系統(tǒng)及開放性測序數(shù)據(jù)分析軟件straitrazor、myflq等，且能容納更多y-str基因座的復(fù)合擴(kuò)增體系具有一定的意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是制備檢測更多y-str基因座的試劑盒，提高了父系親緣關(guān)系分析能力和鑒定效能。本發(fā)明首先保護(hù)引物組合，可包括引物1—引物120；引物1—引物120均為單鏈dna分子，核苷酸序列依次可如seqid**—seqid**20所示。湖南多基因聯(lián)合檢測邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺值得推薦