近幾年，細胞和基因zhiliao（cell & gene therapy，CGT）領(lǐng)域發(fā)展迅猛，在多個方向取得了重大突破，以anti-CD19和BCMA為代的多種CAR-T免疫細胞療法攻克了一部分血液瘤，多種AAV療法也給一些難以成藥的罕見病提供了有效的zhiliao方案。另一方面，基于CRISPR基因編輯技術(shù)的眾多基因療法也進展迅速，較早體外基因編輯療法較快今年年底能夠上市（CRISPR Therapeutics CTX001），體內(nèi)基因編輯療法取得了不錯的臨床數(shù)據(jù)（Intellia Therapeutics NTLA-2001），使用CRISPR技術(shù)制造的通用型CAR-T療法也是免疫細胞療法發(fā)展的一大趨勢（Caribou Biosciences CB-010）。脫靶檢測在揭示CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶機制以及進一步提高系統(tǒng)靶向性的研究中具有重要作用。溫州基因編輯脫靶檢測安全性評價

GUIDE-Seq脫靶評估技術(shù)的優(yōu)勢分析鼓潤致力于基因組編輯工具脫靶的分析檢測工作，為篩選、優(yōu)化基因組編輯工具的保真性提供標準化的分析。我們脫靶分析具有如下優(yōu)勢：實用性強：能反映CRISPR在真核細胞中進行基因編輯的在靶與脫靶情況，以進行安全性和有效性評價；檢測通量高：一次能檢測多個樣本的在靶與脫靶情況，并通過優(yōu)化的標簽設(shè)計，降低實際的測序reads數(shù)量；準確性高：絕大部分檢測結(jié)果可被驗證；靈敏度高：能夠高效檢測出低頻脫靶位點，檢測低至0.1%的脫靶突變；實驗難度低：操作過程簡單易行細胞適應(yīng)性強。off-target脫靶檢測方法如何檢測是否發(fā)生脫靶？

通常不需要進行標準的遺傳毒性組合試驗，但應(yīng)根據(jù)基因zhiliao產(chǎn)品的特點、產(chǎn)品的具體適應(yīng)癥、載體的已有信息、導入基因序列結(jié)構(gòu)等，評估基因zhiliao產(chǎn)品整合進基因組的可能性，判斷是否需要開展另外的遺傳毒性研究，如研究基因組修飾的發(fā)生情況，并檢測隨后可能發(fā)生的異常細胞行為；評估插入突變（插入位點、插入拷貝數(shù)等）引起的遺傳毒性風險。當基因zhiliao產(chǎn)品采用基因編輯或轉(zhuǎn)座子技術(shù)時，需要關(guān)注脫靶編輯、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座印跡引起的遺傳毒性問題；鑒定/表征基因組整合位點。

由于設(shè)計的sgRNA會與非靶點DNA序列錯配，引入非預期的基因突變，即脫靶效應(yīng)(Off-targeteffects)。脫靶效應(yīng)造成了研究中的許多不確定性，這無疑限制了該技術(shù)的應(yīng)用。因此，研究者希望能開發(fā)有效的方法來檢測脫靶效應(yīng)。在目前主流的脫靶效應(yīng)評估方法中，有一種方法為GUIDE-seq，其原理是利用一種短的雙鏈寡聚核苷酸（dsODN）標記CRISPR/Cas誘導的脫靶斷裂，然后對標簽所在的基因組區(qū)域進行高通量測序，通過生物信息學分析從而確定脫靶位點。利用該技術(shù)可以在基因組范圍內(nèi)檢測CRISPR脫靶效應(yīng)，從而改變了以往先預測假定脫靶位點再檢測的思路；與其他的評估方法相比，GUIDE-seq更精確、更靈敏。基因編輯可以‘指哪打哪’,四種脫靶檢測方法。

Cas9蛋白是一種切割外來DNA的酶，像一把分子剪刀。該蛋白通常與兩個RNA分子結(jié)合：crRNA和另一個稱為tracrRNA（或“反式j(luò)ihuocrRNA”）。這兩個RNA分子引導Cas9到它將進行切割的目標部位。這段DNA是與crRNA的20個核苷酸互補的。CRISPR技術(shù)是從細菌和古細菌的自然防御機制中改編而來的。這些生物體使用CRISPR衍生的RNA和各種Cas蛋白，包括Cas9，來阻止病毒和其他異物的攻擊。它們主要通過切碎和破壞外來入侵者的DNA來做到這一點。當這些組件被轉(zhuǎn)移到其他更復雜的生物體中時，它允許對基因進行操縱，或“編輯”。脫靶切割位點已在基因編輯技術(shù),CRISPR / Cas9,ZFNs和TALEN。上海定量脫靶檢測評估標準

種子基因脫靶檢測機構(gòu)推薦唯可。溫州基因編輯脫靶檢測安全性評價

對于基因修飾細胞zhiliao產(chǎn)品，充分的非臨床研究是為了：（1）闡明基因修飾的目的、功能以及產(chǎn)品的作用機制，明確其在擬定患者人群中使用的生物學合理性；（2）為臨床試驗的給藥途徑、給藥程序、給藥劑量的選擇提供支持性依據(jù)；（3）根據(jù)潛在風險因素，闡明毒性反應(yīng)特征，預測人體可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)，確定不良反應(yīng)的臨床監(jiān)測指標，為制定臨床風險控制措施提供參考依據(jù)。因此，應(yīng)充分開展非臨床研究，收集用于風險獲益評估的信息，以確立擬開發(fā)產(chǎn)品在目標患者人群中預期具有合理的、可接受的獲益風險比，同時為臨床試驗的設(shè)計和風險控制策略的制定提供支持性依據(jù)。溫州基因編輯脫靶檢測安全性評價

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