改進(jìn)Cas變體使用SpCas9和SaCas9 變體：已研發(fā)出諸如SpCas9-Nickase、dCas9 、dCas9–FokI、xCas9、Cas9-NG、evoCas9、SpCas9 – HFI、eSpCas9和Hypa-Cas9等多種Cas變體，可降低脫靶效應(yīng)。改進(jìn)的Cas9同源物具有更廣的PAM功能和特異性：實(shí)驗(yàn)表明Cpf1、CRISPR-Cpf1-RNP可降低脫靶效應(yīng)。CRISPR 遞送方法：基于病毒的遞送方法：腺病毒 (AdV) 顯示出整合到靶細(xì)胞基因組中的微弱潛力，這一特征有利于限制脫靶效應(yīng)。然而，AdVs 會引發(fā)免疫反應(yīng)，目前還不能完全排除它與宿主基因組整合的可能性。非病毒遞送方法：當(dāng)sgRNA和Cas9以RNP復(fù)合物形式傳遞時，電穿孔顯示植物原生質(zhì)體中的脫靶突變數(shù)量很低。通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染傳遞RNP復(fù)合物顯示，與質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染相比，脫靶突變的發(fā)生率較小。脫靶檢測guide-sequence，推薦唯可生物，實(shí)驗(yàn)實(shí)力強(qiáng)，專業(yè)性高，檢測效率高，結(jié)果準(zhǔn)確率高。杭州crispr/cas9脫靶檢測安評

細(xì)胞外檢測方法：細(xì)胞外檢測方法較為直接，將基因組提純后進(jìn)行CRISPR體外切割實(shí)驗(yàn)，再捕獲發(fā)生脫靶切割的位點(diǎn)即可。1) Digenome-seqDigenome-seq是較早提出的一類細(xì)胞外脫靶位點(diǎn)檢測方法，提純的基因組DNA被Cas9/sgRNA切割后，再經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)的全基因組測序流程獲得測序數(shù)據(jù)，之后需要較為復(fù)雜的生物信息學(xué)分析才能夠獲得CRISPR切割位點(diǎn)的信息?？傮w來講，這種方法測序成本較高，并且檢測靈敏度也有限。2)SITE-seq為了有效檢測到低頻脫靶位點(diǎn)，一般需要在建庫時定向捕獲CRISPR切割位點(diǎn)。SITE-seq就是這樣一種測序方法，提純的基因組DNA經(jīng)過Cas9/sgRNA切割后，在切割位點(diǎn)末端連接帶Biotin的接頭；再隨機(jī)打斷基因組，在另一端連接第二個接頭；經(jīng)過鏈霉親和素磁珠純化，只有一輪被Cas9切割的DNA才能夠被純化并測序，實(shí)現(xiàn)了CRISPR切割位點(diǎn)的富集。該方法雖然提高了脫靶位點(diǎn)的檢測靈敏度，但有著較高的實(shí)驗(yàn)要求，每次需要投入大量的基因組DNA，并且無法區(qū)分提純基因組DNA時發(fā)生的隨機(jī)斷裂和Cas9的切割，導(dǎo)致產(chǎn)出較為明顯的背景信號。同時，由于一輪Biotin接頭只會接在Cas9切割位點(diǎn)的一側(cè)，導(dǎo)致測序結(jié)果里只能看到脫靶位點(diǎn)一側(cè)的序列。蘇州基因編輯技術(shù)脫靶檢測guide-sequence內(nèi)基因編輯技術(shù)可能造成的脫靶效應(yīng)。

對基于慢病毒/逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的基因zhiliao產(chǎn)品，如出現(xiàn)與可復(fù)制xingbing毒可能相關(guān)的不良事件，還應(yīng)開展可復(fù)制xingbing毒（replicablecompetentlentivirus/retrovirus，RCL/RCR）的檢測。關(guān)于基因編輯產(chǎn)品的特殊考慮基因編輯產(chǎn)品除了適用基因zhiliao產(chǎn)品的一般考慮以及整合性載體的特殊考慮外，長期隨訪中還應(yīng)額外關(guān)注脫靶風(fēng)險，量化評估脫靶活性和在靶活性之間的相關(guān)性，或利用在靶活性來預(yù)測脫靶活性的水平。如果基因zhiliao產(chǎn)品通過全身給yaofang式遞送，長期隨訪中的安全性監(jiān)測不僅包括靶qiguan或靶組織的脫靶活性，而且還應(yīng)包括可能發(fā)生在其他組織和qiguan中的脫靶活性。

目前鼓潤已掌握了該項(xiàng)技術(shù)，簡述如下：1、CRISPR與dsODNtag整合的實(shí)驗(yàn)技術(shù)及高通量測序建庫流程將靶向于目標(biāo)基因組位點(diǎn)的CRISPR質(zhì)粒與dsODNtag以核電轉(zhuǎn)的方式同時轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞，CRISPR造成基因組雙鏈斷裂后，dsODNtag將整合入斷點(diǎn)處，作為后續(xù)分析在靶與脫靶情況的標(biāo)記。轉(zhuǎn)染后3天收集細(xì)胞的DNA進(jìn)行高通量建庫。2、GUIDE-seq生信分析方法1）搭建了高通量測序的數(shù)據(jù)分析流程。2）利用該技術(shù)分析了CRISPR靶向編輯某細(xì)胞系基因的在靶與脫靶情況。其中一例樣品的分析結(jié)果如圖4所示：Sequencesofoff-targetsitesidentifiedbyGUIDE-seq.Theintendedtargetsequenceisshowninthetoplinewithcleavedsitesshownunderneathandwithmismatchestotheon-targetsiteshownandhighlightedincolor.GUIDE-seqsequencingreadcountsareshowntotherightofeachsite.3）利用PCR擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合Sanger測序鑒定了分析出的脫靶位點(diǎn)。脫靶檢測分析，推薦唯可生物，實(shí)驗(yàn)實(shí)力強(qiáng)，專業(yè)性高，檢測效率高，結(jié)果準(zhǔn)確率高。

使用CRISPR/Cas9、ZFNs和TALENs等設(shè)計(jì)核酸酶進(jìn)行基因組編輯，可以將遺傳物質(zhì)定向?qū)氩溉閯游锘蚪M的特定位點(diǎn)。然而，可能會出現(xiàn)非預(yù)期的靶上和靶外基因組修飾，這可能導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，并破壞正?；虻墓δ埽瑥亩赡軐?dǎo)致臨床前和臨床研究中的安全問題?；蚓庉嬆壳暗拿摪蟹治黾夹g(shù)主要依賴于生物信息學(xué)預(yù)測和全基因組脫靶檢測技術(shù)。這些預(yù)測缺乏可靠性，因?yàn)樗鼈冎缓w了潛在基因組改變的一小部分。而頻率低于0.5%的脫靶突變大多無法被全基因組脫靶檢測技術(shù)檢測到。我們是開發(fā)用于全基因組靶向/非靶向分析的無偏分析的先驅(qū)。靶向基因組編輯唯可生物為基因編輯安全性評估提供多方面的PCR和基于NGS的分析。我們的多功能且經(jīng)濟(jì)高效的檢測方法可檢測靶向和非靶向基因組改變。我們先進(jìn)的分析技術(shù)與強(qiáng)大的內(nèi)部生物信息學(xué)體系相結(jié)合，可靠地量化了預(yù)期的靶向整合與非預(yù)期結(jié)果(如易位和INDEL)之間的比率。高深度全基因組重測序服務(wù),該方法能多方位精細(xì)地對基因編輯的細(xì)胞或個體進(jìn)行off-target檢測。浙江基因編輯脫靶檢測分析

通過對DSB的標(biāo)記實(shí)現(xiàn)了全基因組無偏脫靶檢測，如IDLVs、BLESS、GUIDE-seq技術(shù)等。杭州crispr/cas9脫靶檢測安評

基因編輯產(chǎn)品除了適用基因zhiliao產(chǎn)品的一般考慮以及整合性載體的特殊考慮外，長期隨訪中還應(yīng)額外關(guān)注脫靶風(fēng)險，量化評估脫靶活性和在靶活性之間的相關(guān)性，或利用在靶活性來預(yù)測脫靶活性的水平。在開發(fā)過程中應(yīng)同時關(guān)注基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、脫靶效率、插入突變情況、目的基因在靶細(xì)胞中整合位點(diǎn)及表達(dá)。評估基因zhiliao產(chǎn)品整合進(jìn)基因組的可能性，判斷是否需要開展另外的遺傳毒性研究，評估插入突變（插入位點(diǎn)、插入拷貝數(shù)等）引起的遺傳毒性風(fēng)險。需要關(guān)注脫靶編輯、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座印跡引起的遺傳毒性問題；鑒定/表征基因組整合位點(diǎn)。非臨床研究是藥物開發(fā)的重要環(huán)節(jié)之一。杭州crispr/cas9脫靶檢測安評