CAR或TCR修飾的免疫細胞對于嵌合抗原受體（Chimericantigenreceptor，CAR）或T細胞受體（Tcellreceptor，TCR）修飾的免疫細胞，應盡可能采用多種方法評估其靶點相關毒性和脫靶毒性風險。對于靶點相關毒性，應采用體外方法深入分析靶點在人體qiguan、組織和細胞中的表達分布情況，基因表達分析庫和文獻調研也可能會有助于闡明靶點在不同病理生理狀態下的表達是否存在差異。應采用表達和不表達靶抗原的細胞作為靶細胞進行體外試驗，確認CAR或TCR修飾的免疫細胞可特異性的識別和殺傷靶細胞。對于CAR修飾的免疫細胞，應采用多種體外方法評估其胞外抗原識別區的脫靶風險。脫靶檢測技術，推薦唯可生物，實驗實力強，專業性高，檢測效率高，結果準確率高。南京基因編輯技術脫靶檢測實驗室

CIRCLE-seq和CHANGE-seq與SITE-seq同期發表的CIRCLE-seq一定程度上解決了SITE-seq的一些問題。CIRCLE-seq的第一步是將純化后的基因組DNA隨機打斷成300bp左右的片段，然后首尾相連成環狀DNA，這種方法很好地避免了DNA隨機斷裂造成的背景噪聲。實驗的第二步是用Cas9切割環狀DNA，再連上接頭并進行雙端測序，這樣就可以在一次測序中同時獲取切割位點的兩側序列，彌補了SITE-seq的另一個缺點。CIRCLE-seq從總體上來說要優于SITE-seq，但是將基因組DNA隨機打斷后成環的效率并不高，所以同一作者在3年后發表了CHANGE-seq，用Tn5一步法打斷基因組并加接頭，提高了成環效率，降低了起始基因組DNA的用量。南京基因編輯技術脫靶檢測實驗室種子基因脫靶檢測，推薦唯可生物，實驗實力強，專業性高，檢測效率高，結果準確率高。

基因編輯定量脫靶檢測:基因編輯定量脫靶檢測,使用CRISPR/Cas9、ZFNs和TALENs等設計核酸酶進行基因組編輯，可以將遺傳物質定向導入哺乳動物基因組的特定位點。然而，可能會出現非預期的靶上和靶外基因組修飾，這可能導致基因組不穩定，并破壞正常基因的功能，從而可能導致臨床前和臨床研究中的安全問題。.基于PCR的檢測唯可生物采用LTA-PCR方法分析基因組編輯引起的靶向和非靶向整合。1.方便地檢測脫靶目標變化和隨機性2.適用于解決監管機構提出的具體問題3.定制化生物信息學分析基于NGS的檢測唯可生物使用靶向富集測序(TES)進行全基因組檢測和定量靶向和非靶向改變。我們可在一次反應中經濟高效的捕獲所有可能的脫靶事件。1.基于NGS的方法–避免PCR偏倚2.捕獲預測和非預測的脫靶事件3.定制生物信息學分析.

R-loop seq雖然不是一種真正意義上的脫靶位點檢測方法，但能為堿基編輯脫氨酶的脫靶提供一種度量方法，以便于之后的脫氨酶點突變優化，來降低脫靶的發生幾率。2) Detect-seqCRISPR衍生技術由于其復雜性，檢測其脫靶位點的hexin思路是捕獲實驗過程中的關鍵中間產物或者終產物。這種設計思路下，目前較為成功的是檢測堿基編輯CBE脫靶位點的Detect-seq[13]。CBE的原理是將dC脫氨變為dU，迫使其對側的dG變為dA，較終將堿基對從C-G轉變為T-A。Detect-seq便是針對中間態的dU，使用Uracil DNA Glycosylase (UDG)，去除U堿基后，替換為帶Biotin的U堿基，捕獲堿基編輯的脫靶位點，并且sgRNA依賴和sgRNA不依賴的脫靶位點都能找到。該方法類似檢測DNA甲基化的重亞硫酸鹽測序法，通過處理特定的堿基，可以捕獲全基因組上的CBE脫靶位點。選擇潛在的脫靶位點，例如選擇gRNA預測網站上Top 5潛在脫靶位點，進行Sanger測序單克隆；

TCR修飾免疫細胞的脫靶毒性可通過評估TCR與人體自身抗原肽的交叉識別能力來評估。首先，應采用體外試驗測定TCR修飾的免疫細胞與人自身抗原肽-HLA（與遞呈靶抗原肽的HLA等位基因相同）復合物的親和力，并說明抗原肽的選擇依據及選擇范圍。此外，還應研究其他相關或不相關的蛋白中是否含有靶抗原肽序列。如果TCR與人自身抗原肽有交叉反應可能，應確定靶抗原肽的較小識別基序（motif），并采用計算機預測分析評估交叉反應性。如果計算機預測可識別出具有潛在交叉反應性的抗原肽，應在體外測定TCR修飾免疫細胞對表達相應蛋白或遞呈相應抗原肽的的細胞的識別能力。如果不能排除交叉反應性，應基于含有潛在交叉反應性抗原肽的蛋白的表達模式以及TCR與潛在交叉反應性抗原肽的親和力來進行風險評估。為獲得TCR與其他等位HLA潛在交叉反應性的信息，應進行充分的HLA交叉反應性篩選。對于TCR修飾的T細胞，還應關注引入TCR鏈和內源性TCR之間的錯配可能性，應描述和說明旨在降低錯配可能性的TCR設計策略。值得收藏的CRISPR脫靶檢測方法。杭州off-target脫靶檢測評估

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近幾年，細胞和基因zhiliao（cell & gene therapy，CGT）領域發展迅猛，在多個方向取得了重大突破，以anti-CD19和BCMA為代的多種CAR-T免疫細胞療法攻克了一部分血液瘤，多種AAV療法也給一些難以成藥的罕見病提供了有效的zhiliao方案。另一方面，基于CRISPR基因編輯技術的眾多基因療法也進展迅速，較早體外基因編輯療法較快今年年底能夠上市（CRISPR Therapeutics CTX001），體內基因編輯療法取得了不錯的臨床數據（Intellia Therapeutics NTLA-2001），使用CRISPR技術制造的通用型CAR-T療法也是免疫細胞療法發展的一大趨勢（Caribou Biosciences CB-010）。南京基因編輯技術脫靶檢測實驗室