CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌在不斷進化的過程中產(chǎn)生的適應(yīng)性免疫防御機制，它應(yīng)用CRISPR RNA（crRNA）以堿基互補的形式引導(dǎo)相應(yīng)的Cas蛋白識別入侵的外源基因組，并對其DNA進行剪切，用以保護自身的基因組免受外源核酸如噬菌體、病毒等的干擾和破壞。經(jīng)過人為改造后，可在真核細(xì)胞中實現(xiàn)高度靈活且特異的基因組編輯，通過設(shè)計特異性向?qū)NA(Single guide RNA, sgRNA)序列與靶序列進行堿基配對，從而引導(dǎo)Cas蛋白結(jié)合到靶序列處，行使DNA切割功能，然后利用細(xì)胞的非同源性末端連接(Non-homologous end joining, NHEJ)或同源重組(Homologous recombination,HR)修復(fù)機制對斷裂的DNA進行插入缺失(Indel)、修復(fù)(Repair)或替換(Replacement)。由于其相對于鋅指核酸酶(ZFNs)和轉(zhuǎn)錄jihuo因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALENs)技術(shù)更易于操作，而且更高效，因而被廣運用于對基因組特定位點進行靶向編輯。脫靶檢測方法，推薦唯可生物，實驗實力強，專業(yè)性高，檢測效率高，結(jié)果準(zhǔn)確率高。北京脫靶檢測分析

通常不需要進行標(biāo)準(zhǔn)的遺傳毒性組合試驗，但應(yīng)根據(jù)基因zhiliao產(chǎn)品的特點、產(chǎn)品的具體適應(yīng)癥、載體的已有信息、導(dǎo)入基因序列結(jié)構(gòu)等，評估基因zhiliao產(chǎn)品整合進基因組的可能性，判斷是否需要開展另外的遺傳毒性研究，如研究基因組修飾的發(fā)生情況，并檢測隨后可能發(fā)生的異常細(xì)胞行為；評估插入突變（插入位點、插入拷貝數(shù)等）引起的遺傳毒性風(fēng)險。當(dāng)基因zhiliao產(chǎn)品采用基因編輯或轉(zhuǎn)座子技術(shù)時，需要關(guān)注脫靶編輯、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座印跡引起的遺傳毒性問題；鑒定/表征基因組整合位點。深圳育種脫靶檢測政策種子基因脫靶檢測機構(gòu)推薦唯可。

改進Cas變體使用SpCas9和SaCas9 變體：已研發(fā)出諸如SpCas9-Nickase、dCas9 、dCas9–FokI、xCas9、Cas9-NG、evoCas9、SpCas9 – HFI、eSpCas9和Hypa-Cas9等多種Cas變體，可降低脫靶效應(yīng)。改進的Cas9同源物具有更廣的PAM功能和特異性：實驗表明Cpf1、CRISPR-Cpf1-RNP可降低脫靶效應(yīng)。CRISPR 遞送方法：基于病毒的遞送方法：腺病毒 (AdV) 顯示出整合到靶細(xì)胞基因組中的微弱潛力，這一特征有利于限制脫靶效應(yīng)。然而，AdVs 會引發(fā)免疫反應(yīng)，目前還不能完全排除它與宿主基因組整合的可能性。非病毒遞送方法：當(dāng)sgRNA和Cas9以RNP復(fù)合物形式傳遞時，電穿孔顯示植物原生質(zhì)體中的脫靶突變數(shù)量很低。通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染傳遞RNP復(fù)合物顯示，與質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染相比，脫靶突變的發(fā)生率較小。

對于CAR修飾的免疫細(xì)胞，應(yīng)采用多種體外方法評估其胞外抗原識別區(qū)的脫靶風(fēng)險。TCR修飾免疫細(xì)胞的脫靶毒性可通過評估TCR與人體自身抗原肽的交叉識別能力來評估。首先，應(yīng)采用體外試驗測定TCR修飾的免疫細(xì)胞與人自身抗原肽-HLA（與遞呈靶抗原肽的HLA等位基因相同）復(fù)合物的親和力，并說明抗原肽的選擇依據(jù)及選擇范圍。此外，還應(yīng)研究其他相關(guān)或不相關(guān)的蛋白中是否含有靶抗原肽序列。如果TCR與人自身抗原肽有交叉反應(yīng)可能，應(yīng)確定靶抗原肽的較小識別基序（motif），并采用計算機預(yù)測分析評估交叉反應(yīng)性。如果計算機預(yù)測可識別出具有潛在交叉反應(yīng)性的抗原肽，應(yīng)在體外測定TCR修飾免疫細(xì)胞對表達(dá)相應(yīng)蛋白或遞呈相應(yīng)抗原肽的的細(xì)胞的識別能力。如果不能排除交叉反應(yīng)性，應(yīng)基于含有潛在交叉反應(yīng)性抗原肽的蛋白的表達(dá)模式以及TCR與潛在交叉反應(yīng)性抗原肽的親和力來進行風(fēng)險評估。為獲得TCR與其他等位HLA潛在交叉反應(yīng)性的信息，應(yīng)進行充分的HLA交叉反應(yīng)性篩選。脫靶檢測實驗室，推薦唯可生物，實驗實力強，專業(yè)性高，檢測效率高，結(jié)果準(zhǔn)確率高。

CIRCLE-seq和CHANGE-seq與SITE-seq同期發(fā)表的CIRCLE-seq一定程度上解決了SITE-seq的一些問題。CIRCLE-seq的第一步是將純化后的基因組DNA隨機打斷成300bp左右的片段，然后首尾相連成環(huán)狀DNA，這種方法很好地避免了DNA隨機斷裂造成的背景噪聲。實驗的第二步是用Cas9切割環(huán)狀DNA，再連上接頭并進行雙端測序，這樣就可以在一次測序中同時獲取切割位點的兩側(cè)序列，彌補了SITE-seq的另一個缺點。CIRCLE-seq從總體上來說要優(yōu)于SITE-seq，但是將基因組DNA隨機打斷后成環(huán)的效率并不高，所以同一作者在3年后發(fā)表了CHANGE-seq，用Tn5一步法打斷基因組并加接頭，提高了成環(huán)效率，降低了起始基因組DNA的用量。脫靶檢測政策，推薦唯可生物，實驗實力強，專業(yè)性高，檢測效率高，結(jié)果準(zhǔn)確率高。深圳crispr/cas9脫靶檢測評估

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不同基因zhiliao產(chǎn)品的特殊考慮。關(guān)于整合性載體的特殊考慮如受試者接受整合性載體基因zhiliao產(chǎn)品，例如轉(zhuǎn)座子元件、γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒及其他逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，或利用整合性載體或基于轉(zhuǎn)座子的載體在體外修飾的細(xì)胞，長期隨訪中需格外關(guān)注基因zhiliao產(chǎn)品的基因組整合風(fēng)險，建議申辦方分析基因zhiliao載體在靶細(xì)胞或相關(guān)替代細(xì)胞的基因組中整合的影響（例如是否存在克隆性生長、是否存在優(yōu)勢克隆、克隆性生長是否導(dǎo)致惡性liu等）。如果基因組整合相關(guān)風(fēng)險的分析可行，應(yīng)注意以下幾點：?在接受基因zhiliao產(chǎn)品的較初5年內(nèi)，兩次檢測間的采樣間隔建議不超過6個月。此后每年至少檢測一次，直至檢測數(shù)據(jù)表明不再存在任何安全性風(fēng)險。北京脫靶檢測分析