數字PCR的引物和探針設計規則同熒光定量PCR是類似的，具體規則如下：1、查找和選擇目標序列設計引物和探針的第一步是得到感興趣基因的核酸序列。找到基因保守區域：基因的保守區域是指來自同一屬/種/亞型的、在某個基因上堿基序列差別很小或沒有差別的區域。根據需要，使用ClustalX或ClustalW等軟件對齊屬于同一屬/種/亞型的基因的一組序列，在對齊序列的保守區域設計引物，并確保引物結合位點處的保守序列與其它非待檢測的屬/種/亞型的堿基序列具有較大的差異。擴增產物長度（AmpliconLength）：可在75-200bp之間（產物長度=下游引物位置-上游引物位置+1）。3D數字PCR是基于納米流體芯片進行檢測，通過一次檢測，將樣品分到數千個單獨的PCR。美國全自動多重數字PCR性能特點

數字PCR技術流分類目前，dPCR的基本方法都已經建立，根據反應單元的不同形式，主要可分為微板式、微腔式和和微滴式三大類系統。微液滴制備的方法，目前主流的有四種：1）芯片微孔物理分割法，俗稱物理分隔法，公司有Fluidgm，Qiagen，Roche，ThermoFisher，;2）液滴分割法，俗稱油包水，代替公司有Bio-Rad;3）雜交式芯片液滴法，公司有Stilla;4）注射振動制滴法。PS：芯片式物理分割技術所有已經過期，目前有不少公司在這個技術的基礎上進行開發，例如羅氏。全自動數字PCR儀器數字PCR的兩大應用場景在于基因檢測、無創出生缺陷篩查。

根據泊松分布的定義和適用條件可知，如果我們設微液滴總數為N，投入的靶序列拷貝數為M，那么“每個微液滴中的靶序列拷貝數”的概率分布是近似滿足泊松分布的。理解之前，首先要明確一點，在檢測的過程中，并不是說一個樣本中檢測到了幾個亮點，這個反應當中就有幾個目標基因的拷貝。因為目標基因的片段，在微滴當中的分布，是符合泊松分布的（也就是說進不進的概率相等，并且相互獨立）。所以，一個發光的微滴中，可能有一個或者三個四個，甚至更多個目標基因的拷貝。因此，發光的微滴數與原始的基因拷貝數并不是一對一的對應關系。

作為時下的熱點技術，數字PCR是將核酸樣品分配到大量單獨、平行的微反應單元（nL，納升級別）中，使得每個反應單元中盡可能含有1個模板分子，并在此基礎上進行擴增、檢測和分布統計，從而實現靶標分子的比較 計數。（圖：數字PCR技術原理）根據微反應單元的不同形式，數字PCR產品可分為微板式、微滴式和芯片式等。目前，市場上主要的數字PCR產品主要是基于微滴式和芯片式，如Bio-Rad公司的QX200微滴式系統和ThermoFisher公司的QuantStudio系統等。與一、二代PCR技術相比，數字PCR具有很多優勢：一是特異性、靈敏性均有顯著提高；二是在不依賴內參和標準曲線的前提下，可直接得到比較 量化指標；三是微反應單元相互獨立、封閉，避免了PCR抑制劑及不同核酸分子擴增產物間的相互干擾，準確度和可重復性較高。拷貝數變異、突變檢測、基因相對表達研究、二代測序結果驗證、miRNA表達分析、單細胞基因表達分析等。

dPCR的測量結果通常表示為含量，即拷貝數值或轉基因質量百分比，而QPCR結果通常表示為拷貝數的質量分數。目前市場上可購買到大多數轉基因標準物質，以qPCR定值的標準物質是以拷貝數（單倍體基因組當量）的質量分數來表示特性量；以dPCR定值的標準物質直接采用拷貝數比例來表示特性量。不同方法使用不同的表示方式，會造成測量結果不可比。因此質量分數、拷貝數和拷貝數比例之間的關系需要轉化，才能得到單位一致，數值可比的數據。EU聯合研究中心建議使用轉換因子從拷貝數換算到質量分數。經過PCR循環之后，有一個核酸分子模板的反應器就會給出熒光信號，沒有模板的反應器就沒有熒光信號。數字PCR原理

通過創新技術微流控芯片，讓數字PCR單反應耗材價格進入個位數，實現了新的進步，也降低開發難度。美國全自動多重數字PCR性能特點

引物設計（DesignPrimers）：引物長度（PrimerLength）：18-25個堿基之間。短的引物更易于同靶序列結合，但過短的引物也更可能同基因組上的多個區域相結合而產生非特異性擴增產物。更長的引物會提高同靶序列結合的特異性，但過長的引物（>30bp）同靶序列結合速度變慢，降低結合率。引物長度和組成直接影響引物Tm值（PrimerMeltingTemperature）和退火溫度（AnnealingTemperatures）。引物的組成——GC%含量（GCContent）：指引物總堿基中G和C堿基數量的百分比，該值應在40-60%之間。如果模板序列的GC含量較高，推薦使用較高Tm值的引物。美國全自動多重數字PCR性能特點

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