數字PCR是一種核酸分子定量技術。當前核酸分子的定量有三種方法,光度法基于核酸分子的吸光度來定量;實時熒光定量PCR(RealTimePCR)基于Ct值,Ct值就是指可以檢測到熒光值對應的循環數;數字PCR是的定量技術,基于單分子PCR方法來進行計數的核酸定量,是一種定量的方法。主要采用當前分析化學熱門研究領域的微流控或微滴化方法,將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應器或微滴中,每個反應器的核酸模板數少于或者等于1個。這樣經過PCR循環之后,有一個核酸分子模板的反應器就會給出熒光信號,沒有模板的反應器就沒有熒光信號。根據相對比例和反應器的體積,就可以推算出原始溶液的核酸濃度。全自動數字PCR一體機可以適用于包括醫療檢測領域在內的多種應用場景。廣東數字PCR系統
相比于qPCR,dPCR在轉基因檢測中具有以下優勢:(1)檢測靈敏度高:理論上dPCR的靈敏度可達1個拷貝,而實際應用中dPCR的小檢出限和比較低定量限數值非常接近,所以dPCR可以在非常低的目標拷貝數下得到精確的結果;通常轉基因比參考基因(內源基因)濃度低很多;(2)前處理簡單且受基質成分干擾較?。篸PCR反應效率和精密度受到食品基質成分干擾影響較小,可應用于混合基質樣品中低豐度DNA的檢測;(3)dPCR對抑制劑的敏感性較低:由于dPCR結果表示為“有熒光“或“無熒光”,即使存在抑制劑降低了熒光強度仍可以表示為“有熒光;(4)適合多重轉基因檢測:食品或飼料提取的DNA中可能包含多種轉基因片段,可以進行多重dPCR檢測,提高分析效率。同時,dPCR可以直接溯源至SI國際單位制摩爾,適合單一、雙重及多重轉基因標準物質研究,一次可識別不同的轉基因區域。下面詳細進行說明。上海全自動多重數字PCR價格通過數字PCR技術可建立多重熒光體系,用于同時檢測比如非小細胞中常見的MET和HER2耐藥擴增。
數字PCR技術是繼一代普通PCR、二代熒光定量PCR之后的第三代PCR技術。該技術將一個樣本分成幾到幾十萬份,分配到不同的反應單元,每個單元包含一個或多個拷貝的目標分子(DNA模板),在每個反應單元中分別對目標分子進行PCR擴增;擴增結束后,將有熒光信號的微滴判讀為1,沒有熒光信號的微滴判讀為0,終根據泊松分布原理以及陽性微滴的比例,計算出待檢靶分子的濃度或拷貝數。定量:不再依賴于Ct值和標準曲線,直接給出靶序列的起始濃度,實現真正意義上的定量。更高靈敏度與特異性:數字PCR可實現萬分之一稀有樣本的定量,可用于極微量核酸樣本檢測、復雜背景下的稀有突變檢測、表達量微小差異鑒定、單細胞基因表達等方面。數字PCR在分子診斷領域將會發揮巨大的作用,數字PCR適用于生物標志物研究、拷貝數變異分析、微生物檢測、轉基因生物檢測、mRNA和miRNA檢測、基因相對表達研究等,并對遺傳病、、產前診斷的研究提供了一種全新的技術思路與手段,具有廣的、不可替代的應用前景。
20世紀末,Vogelstein等提出數字PCR(digitalPCR,dPCR)的概念,通過將一個樣本分成幾十到幾萬份,分配到不同的反應單元,每個單元至少包含一個拷貝的目標分子(DNA模板),在每個反應單元中分別對目標分子進行PCR擴增,擴增結束后對各個反應單元的熒光信號進行統計學分析。PCR實際上是一個在模板DNA、引物(模板片段兩端的已知序列)和四種脫氧核苷酸等存在的情況下,DNA聚合酶依賴的酶促合成反應,擴增的特異性取決于引物與模板DNA的特異結合。楊雁峰博士堅信數字PCR是可以應用于無創產前篩查的理想技術之一,這也是他2016年創立塔歌生物的初衷。
dPCR的測量結果通常表示為含量,即拷貝數值或轉基因質量百分比,而QPCR結果通常表示為拷貝數的質量分數。目前市場上可購買到大多數轉基因標準物質,以qPCR定值的標準物質是以拷貝數(單倍體基因組當量)的質量分數來表示特性量;以dPCR定值的標準物質直接采用拷貝數比例來表示特性量。不同方法使用不同的表示方式,會造成測量結果不可比。因此質量分數、拷貝數和拷貝數比例之間的關系需要轉化,才能得到單位一致,數值可比的數據。EU聯合研究中心建議使用轉換因子從拷貝數換算到質量分數。檢測結果部分為陽性,部分為陰性,之后進行分子數統計,不需做標曲。法國微滴式數字PCR
通過創新技術微流控芯片,讓數字PCR單反應耗材價格進入個位數,實現了新的進步,也降低開發難度。廣東數字PCR系統
數字PCR產品的發展,為不同場景下的多樣化核酸檢測需求提供了新的思路,尤其是在醫學檢驗方面,在 性疾病早期檢測、病癥的液體活檢、無創產前檢查等領域展現出良好的應用前景。實現 性疾病早期高效檢測——以病毒為例,有病毒檢測、和臨床樣本病毒載量評估He監測環境病毒載量;二代熒光定量PCR檢測技術是目前病毒檢測的"金標準",但由于病毒探針結合位點突變、樣本病毒載量不足等原因,在臨床檢測過程中經常出現假陰性結果,由于數字PCR具有更高的靈敏度、精細度,以及其適合痕量樣本檢測的特性,能夠檢測出熒光定量PCR檢測過程中錯過的 ,可作為后者的補充。在人群篩查及臨床診療中,為科學選取采樣方式,需要評估不同臨床樣本病毒載量,如鼻咽拭子、血尿、糞便、肺泡灌洗液等,由于數字PCR可提供一定程度上量化指標,為采樣方法的選取提供了參考,從而提高檢出率。在外防輸入的戰略要求下,環境病毒檢測工作尤為重要,數字PCR可對低核酸豐度樣本進行有效檢測,包括從不同環境中取樣的樣本,如病房、醫院衛生間、實驗室等等,在病情防控中起到了不可忽視的作用。此外,數字PCR的應用場景還有病程不同階段的病毒載量評估、核酸參考品制備、抗病毒藥物研發等環節。廣東數字PCR系統
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