隨著技術的發展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優化，結合它的特點，大致可以分成深和活兩個方面的提升。要想讓激發激光進入更深的層面，大致可從兩個方面入手，裝置優化與標本改造。關于裝置優化，我們可以把激光束變得更細，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關于標本，其中影響光傳播的主要是物質吸收和散射，解決這個問題，我們需要對樣本進行透明化處理。一種方法是運用某種物質將標本浸泡，使其中的物質（主要是脂質）被破壞或溶解。另一種方法是運用電泳將脂質電解，讓標本“透明度”提高。雙光子顯微鏡在組織透明化成像中應用；ultima2PPLUS雙光子顯微鏡作用

雙光子顯微鏡的應用由于適合動態成像，雙光子顯微鏡一經問世便很快應用于神經科學、遺傳發育、藥物代謝等領域。雙光子顯微鏡能夠在細胞甚至是亞細胞水平上對***神經細胞的形態結構、離子濃度、細胞運動、分子相互作用等進行直接成像監測，而且能夠進行光裂解、光轉染和光損傷等光學操縱。同時，雙光子顯微鏡能動態監測**在體內的生長和轉移，并可對**治療過程中*細胞的變化進行實時觀測和評估。隨著光學技術、熒光探針技術、計算機成像技術的發展，雙光子顯微技術會得到更大提升和更廣的應用，未來不僅用于基礎研究，也將擴展到臨床應用。國外雙光子顯微鏡代理商雙光子顯微鏡品牌有哪些？

雙光子顯微成像技術不是什么新技術，早在20多年前就有了，目前已經在生命科學和材料科學中廣泛應用。幾年前雙光子過期后，已經推出自己的雙光子顯微鏡的廠家估計不少于10家以上。即便如此，世界上很多實驗室都搭雙光子，自己搭的好處有很多，首先是便宜，尤其是實驗室已經有飛秒激光器，那就更很省錢了。其次是靈活，可以選擇針對特殊用途的搭配，改動也靈活。好處就是可以鍛煉隊伍，一趟走下來可以把新手帶出來，后期維護也更加自由。當然壞處也不少，首先是操心，特別是第1次搭的時候，開始要想方案，后來要解決各種實際問題。其次是花時間，加上買配件的時間，比買一臺現成的商業化雙光子耗時長。現在已經有不少關于如何搭雙光子顯微鏡的文章，各種protocol，大多是老外寫的，中文的較少。其實完全自己搭一套好用的系統還是不容易的，尤其是沒有經驗的時候，容易走彎路，多花錢，也多花時間，再加上雙光子的重要器件都需要從國外購買，在國內買這些東西耗時較長。因此，我想總結一下我們的經驗，貼出來分享，希望能幫到想自己動手的實驗室，

WinfriedDenk較初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可，但是使用很不方便所以遠未實現商用。很快雙光子顯微鏡的標配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態光源優勢，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深，對生物樣品損傷更小。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置，鈦寶石飛秒可調諧激光器位于平臺較左邊。從雙光子到三光子科學家正在從雙光子轉向三光子顯微鏡。1996年，ChrisXu在康奈爾大學(Denk同導師實驗室)讀博期間發明了三光子顯微鏡，如果雙光子吸收可行，那么三光子看起來也是自然的發展方向。三光子成像使用更長的波長，大約在1.3和1.7微米，其成像深度也比雙光子更深，目前記錄約為2.2毫米，人類大腦皮層厚約4毫米。相比雙光子顯微鏡，三光子還要求以較低重頻使用更強和更短的激光脈沖，而傳統的鈦寶石激光器難以達到這些要求，但是對于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)。雙光子顯微鏡在組織透明化成像中應用。

雙光子顯微鏡為什么穿透能力強？生物組織在近紅外波段存在兩個窗口,第1個近紅外窗口對應波長在700nm-900nm,第2個近紅外窗口對應波長在1000nm-1400nm之間。舉例說明就是單晶硅對于可見光幾乎是不透明的，但是對于紅外波段就像是“水晶”一樣通透性很好了。原因有兩點：1.生物組織對紅外光的吸收弱，對可見光吸收強。類似的，平時用手電筒照射手指，會看到手通透紅亮，也是由于生物組織對長波長的紅光吸收少。2.生物組織對紅外光的散射弱。因為瑞利散射的強度反比于波長λ的四次方。類似的，早晨的太陽非常紅，也就是因為長波長的紅光穿透力更強。這兩點共同導致長波長的紅外光比可見光對生物組織的穿透能力強。雙光子顯微鏡可以在小鼠的的任何部位進行有生命體成像。美國ultima雙光子顯微鏡授權商

對于顯微成像技術包含：寬場熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、轉盤共聚焦顯微鏡、雙光子顯微鏡。ultima2PPLUS雙光子顯微鏡作用

雙光子顯微鏡是結合了雙光子激發技術和激光掃描共聚顯微鏡的一種新型熒光顯微鏡，其原理大致是這樣的：首先，讓我們來看看什么是熒光顯微鏡。熒光顯微鏡是以紫外線為光源，照射被檢物體上的熒光物質或是熒光染料，使其發出熒光。相比普通光學顯微鏡，熒光顯微鏡運用了波長更短的紫外線，再將可見光過濾掉，提高了分辨力率。而當被檢物體過厚時，從不同深度發出的熒光都會打在物鏡上，使觀察到的像模糊、發虛，無法清楚的知道被檢物體的結構。而激光掃描共聚顯微鏡就是在熒光顯微鏡的基礎上，增加了激光掃描裝置，從而解決了上述問題。激光共聚掃描顯微鏡脫離了傳統光學顯微鏡的場光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源，激光束經照明孔，經由分光鏡反射至物鏡，并聚焦于樣品上，對標本焦平面上每一點進行掃描。組織樣品中的熒光物質受到刺激后發出的熒光經原來入射光路直接反向回到分光鏡，通過探測孔時先聚焦，然后被光探頭收集，轉化為信號輸送到計算機進行處理。這個裝置能讓通過探測***的只有焦平面上發出的熒光，使成像更為清晰準確，同時通過改變物鏡的焦距，能對不同焦平面進行掃描，通過計算機繪出普通顯微鏡無法觀測的三維圖像。ultima2PPLUS雙光子顯微鏡作用