由于具有較高輸出功率的光源可以提高成像速度，在我們的實驗中，時間分辨率主要是受OPO輸出可見光激光功率的限制。盡管在單點掃描系統中，v2PE激發會使得空間分辨率提高，但多聚焦v2PE顯微鏡具有與1PE多聚焦顯微鏡近乎相同的橫向分辨率，這主要是多聚焦成像和單點掃描技術之間的差異造成的。由于v2PE的激發體積小于1PE，引入圖像掃描技術可以進一步提高空間分辨率，這種技術需要通過在陣列前引入額外的微透鏡陣列來實現。除此之外，由于可見光區域的共振效應，可能會產生光漂白，因而為了延長觀察時間，系統還需要對激發強度和曝光時間做進一步優化。雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優化，結合它的特點，大致可以分成深和活兩個方面的提升。國外ultimainvestigator雙光子顯微鏡掃描深度

隨著技術的發展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優化，結合它的特點，大致可以分成深和活兩個方面的提升。要想讓激發激光進入更深的層面，大致可從兩個方面入手，裝置優化與標本改造。關于裝置優化，我們可以把激光束變得更細，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關于標本，其中影響光傳播的主要是物質吸收和散射，解決這個問題，我們需要對樣本進行透明化處理。一種方法是運用某種物質將標本浸泡，使其中的物質（主要是脂質）被破壞或溶解。另一種方法是運用電泳將脂質電解，進而讓標本“透明度”提高。國外ultima雙光子顯微鏡分辨率雙光子顯微鏡可精確穿透較厚標本進行定點、有生命體的觀察！

從雙光子的原理和特點，我們可以清楚地得出雙光子的優點:☆光損傷小:由于雙光子顯微鏡采用可見光或近紅外光作為激發光源，因此該波段的光對細胞和組織的光損傷很小，適合長期研究；☆穿透能力強:與紫外光相比，可見光和近紅外光的穿透能力更強，因此受生物組織散射的影響更小，解決了生物組織深層物質的層析成像問題；☆高分辨率:由于雙光子吸收的截面很小，只能在焦平面很小的區域激發熒光，雙光子吸收被限制在焦點處體積約為波長三次方的范圍內；☆漂白區域小:由于激發只存在于交點處，焦點外的區域不會發生光漂白；☆熒光收集率高:與共焦成像相比，雙光子成像不需要濾光片(共焦)，提高了熒光收集率，直接導致圖像對比度的提高；☆圖像對比度高:由于熒光波長小于入射波長，瑞利散射產生的背景噪聲*為單光子激發產生的1/16，減少了散射的干擾；光子躍遷具有很強的選擇性激發，因此可以用來對生物組織中的一些特殊物質進行成像；

配合了雙光子激發技術，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發揮功效。那么什么是雙光子激發技術呢？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級，經過一個很短的時間后，電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子（P=h/λ）。利用這個原理，便誕生了雙光子激發技術。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光，通過物鏡匯聚，由于雙光子激發需要很高的光子密度，而物鏡焦點處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點處才能發生雙光子激發，產生熒光，該點產生的熒光再穿過物鏡，被光探頭接收，從而達到逐點掃描的效果。由于其非侵入性和高分辨率的特點，雙光子顯微鏡成為了研究神經科學、ai癥研究、免疫學等領域的重要工具。

雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主提出，30年后因為有了激光才得到實驗驗證，但是到WinfriedDenk發明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術挑戰和飛秒激光發揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當于和頻產生非線性過程，這要求極高的電場強度，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關，所以關鍵變量只剩下激光脈寬?；谝陨戏治?，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標準激發光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強低無法被激發，所以雙光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可，但是使用很不方便所以遠未實現商用。很快雙光子顯微鏡的標配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態光源優勢，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深，對生物樣品損傷更小。雙光子顯微鏡知多少。進口ultima2PPLUS雙光子顯微鏡授權供應商

如果已經有了飛秒光，就可以幾套雙光子顯微鏡共享一臺，只需分光即可。國外ultimainvestigator雙光子顯微鏡掃描深度

細胞內鈣離子作為重要的信號分子其作用具有時間性和空間性。當個細胞興奮時，產生了一個電沖動，此時，細胞外的鈣離子流入該細胞內，促使該細胞分泌神經遞質，神經遞質與相鄰的下一級神經細胞膜上的蛋白分子結合，促使這一級神經細胞產生新的電沖動。以此類推，神經信號便一級一級地傳遞下去，從而構成復雜的信號體系，終形成學習、記憶等大腦的高級功能。在哺乳動物神經系統中，鈣離子同樣扮演著重要的信號分子的角色。靜息狀態下大部分神經元細胞內鈣離子濃度約為50-100nM，而細胞興奮時鈣離子濃度能瞬間上升10-100倍，增加的鈣離子對于突觸囊泡胞吐釋放神經遞質的過程必不可少。眾所周知，只有游離鈣才具有生物學活性，而細胞質內鈣離子濃度由鈣離子的內外流平衡所決定，同時也受鈣結合蛋白的影響。細胞外鈣離子內流的方式有很多種，其中包括電壓門控鈣離子通道、離子型谷氨酰胺受體、煙堿型膽堿能受體（nAChR）和瞬時受體電位C型通道（TRPC）等。神經元鈣成像的原理就是利用特殊的熒光染料或鈣離子指示劑將神經元中鈣離子濃度的變化通過熒光強度表現出來，以反映神經元活性。該方法可以同時去觀察多個功能或位置相關的腦細胞。國外ultimainvestigator雙光子顯微鏡掃描深度