目前，腦科學的研究在全球范圍內如火如荼，中國的腦計劃也即將啟動。其中，全景式分析腦連接圖和功能動態圖的研究成為重點研究方向，如何打破尺度壁壘，將微觀神經元和突觸的信息處理和個體行為信息與全腦融合，是該領域亟待解決的關鍵挑戰。2021年1月6日，由北京大學分子醫學研究所牽頭，北京大學信息科學與技術學院電子系、工程學院和中國人民醫學科學院組成的跨學科團隊在NatureMethods上在線發表了一篇題為《大視場、多平面、長程腦成像的微型雙光子拷貝》的文章。本文報道了第二代小型化雙光子熒光顯微鏡FHIRM-TPM2.0。其成像視場是團隊2017年發布的第1代小型化顯微鏡的7.8倍。同時具有三維成像能力，獲得了小鼠自由運動行為時大腦三維區域數千個神經元清晰穩定的動態功能圖像，實現了對同一批次神經元一個月的跟蹤記錄。上海雙光子顯微鏡就找因斯蔻浦。國外ultimainvestigator雙光子顯微鏡授權公司

WinfriedDenk使用的第1個光源是染料飛秒激光(脈沖寬度100fs，可見光波長630nm)。染料激光雖然實驗室演示可以接受，但是使用起來不方便，所以離商業化還很遠。很快雙光子顯微鏡的標準光源變成了飛秒鈦寶石激光器。鈦寶石激光器除了具有固態光源的優點外，還具有近紅外波長調諧范圍寬，而近紅外比可見光穿透更深，對生物樣品的損傷更小。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置，鈦寶石飛秒可調諧激光器位于平臺左側。從雙光子到三光子科學家們正在從雙光子顯微鏡轉向三光子顯微鏡。1996年，ChrisXu在康奈爾大學(Denk的導師實驗室)讀博時發明了三光子顯微鏡。如果雙光子吸收是可行的，那么三光子似乎是自然的發展方向。三光子成像使用更長的波長，大約1.3和1.7微米，成像深度比雙光子更深。目前錄音大約2.2毫米，人的大腦皮層厚度大約4毫米。與雙光子顯微鏡相比，三光子需要使用更強、更短、重復率更低的激光脈沖，這是傳統的鈦寶石激光器很難滿足的，但對于摻鐿光纖飛秒光參量放大器，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)就非常容易。國外激光熒光雙光子顯微鏡授權商雙光子顯微鏡在生物醫學研究中有廣泛的應用，可以觀察細胞內的亞細胞結構、蛋白質分布、細胞活動等。

雙光子熒光顯微鏡是結合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發技術的一種新技術。雙光子激發的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子，在經過一個很短的所謂激發態壽命的時間后，發射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發熒光分子是相同的。雙（多）光子成像優勢在于，具有更深的組織穿透深度，利用紅外光，能夠在層面檢測極限達1mm的組織區域；因信號背景比高，而具有更高的對比度；因激發體積小，具有定點激發的特性，具有更少的光毒性；激發波長由紫外、可見光調整為紅外激發，能夠更加地安全。

雙光子顯微鏡是一種先進的成像技術，能夠實現細胞或組織的深層觀察。它的主要特點是使用雙光子激發來產生熒光，從而實現對生物樣品的高分辨率成像。雙光子顯微鏡的工作原理是利用激光的脈沖寬度極窄的特性，將高能激光束聚焦到生物樣品中，激發出熒光。這個過程需要使用一個特殊的雙光子激發源，它能夠將一個光子轉換為兩個光子，其中一個光子用于激發熒光，另一個光子則用于成像。雙光子顯微鏡具有以下優點：高分辨率：由于雙光子激發的特性，可以實現對生物樣品的高分辨率成像，特別是對于深層組織的觀察。穿透深度大：雙光子激光的波長較長，能夠更好地穿透生物組織，從而實現對深層細胞的觀察。熒光壽命長：雙光子激發產生的熒光壽命比單光子激發產生的熒光壽命長，這使得雙光子顯微鏡能夠更好地區分不同的熒光標記物。減少光毒性：由于雙光子激發的能量較低，因此對生物樣品的損傷較小，可以減少光毒性。總之，雙光子顯微鏡是一種非常有用的成像技術，可以用于生物學、醫學、材料科學等領域的研究。這種雙光子顯微鏡的視場是普通顯微鏡的10倍。

雙光子顯微鏡(2PM)可以對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器進行亞細胞分辨率的成像，從而測量不透明腦深部的活動。成像膜的電壓變化可以直接反映神經元的活動，但神經元活動的速度對于常規的2PM來說太快了。目前，電壓成像主要由寬視場顯微鏡實現，但其空間分辨率較差，且只能在淺深度成像。因此，為了以高空間分辨率成像不透明腦中膜電壓的變化，需要將成像速率提高2PM。面向模塊輸出端的子脈沖序列可視為從虛擬光源陣列發出的光，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成空間分離和時間延遲的聚焦陣列。然后，該模塊被集成到一個帶有高速數據采集系統的標準雙光子熒光顯微鏡中，如圖2所示。光源是重復頻率為1MHz的920nm激光器。FACED模塊可以產生80個脈沖焦點，脈沖時間間隔為2ns。這些焦點是虛擬源的圖像。虛光源越遠，物鏡處的光束尺寸越大，焦點越小。光束可以沿Y軸比沿X軸更好地填充物鏡，從而在X軸上產生0.82m和0.35m的橫向分辨率。于雙光子激發需要兩個光子同時到達，因此只有在焦點附近的樣品區域才會激發，從而實現三維成像和高分辨率。國外激光熒光雙光子顯微鏡授權商

雙光子顯微鏡角膜成像。國外ultimainvestigator雙光子顯微鏡授權公司

首先，雙光子成像采用波長范圍約在700~1000nm的近紅外光激發，在組織中的散射系數較小，穿透性很好，因此非常適合厚樣本的觀察。同時，由于是近紅外光激發，也能避免樣品中激發波長較短的自發熒光物質的干擾，可獲得較強的熒光信號（如下圖）。所以雙光子成像具有較深的穿透力和較小的光毒性。通常在活物腦組織中雙光子顯微鏡有效成像深度可達200~500μm，能夠較好地進行三維成像。雙光子成像的另一大優勢在于精確的空間點聚焦性。一般條件下，物質只會被單光子激發，只有在光子密度足夠高的情況下，物質才會吸收兩個光子從而被激發，所以，雙光子只會在光子密度蕞高的物鏡焦點附近發生，很少產生焦平面外的雜散光（如下圖）。這種性質既提高了成像質量，也降低了樣本的光漂白、光損傷區域。基于這些優勢，使得雙光子顯微鏡非常適合對活細胞、活組織進行長時間在體成像。國外ultimainvestigator雙光子顯微鏡授權公司