通過對顯微光學系統的重新設計，將FHIRM-TPM2.0的成像視場擴展至420×420平方微米，顯微物鏡的工作距離擴展至1mm，實現無創成像。嵌入可拆卸的快速軸向掃描模塊，實現深度180微米的三維體成像和多平面快速切換的實時成像。該模塊由一個快速電動變焦鏡頭和一對中繼鏡頭組成，在不同深度成像時保持放大率恒定。其中，變焦模塊重1.8克，科研人員可以根據實驗要求自由拆卸。此外，新型微型成像探頭可以瞬間插拔，極大簡化了實驗操作，避免了長時間實驗對動物的干擾。反復裝卸探針追蹤同批神經元時，視場旋轉角度小于0.07弧度，邊界偏差小于35微米。雙光子顯微鏡結合了雙光子激發技術和激光掃描共聚顯微鏡。國內激光熒光雙光子顯微鏡授權公司

生物樣品的三維觀察是了解細胞功能的重要方法之一。目前已有的三維熒光成像技術有光學顯微鏡、點陣照明和激光掃描顯微鏡(如共焦顯微鏡和雙光子顯微鏡)。其中，激光掃描顯微鏡利用轉盤可以進行多焦點激光掃描，提高了時間分辨率，有利于減少活細胞成像中的光損傷。本文主要實現可見光雙光子激發和多焦點激光掃描的結合，**終提高三維延遲掃描中的空間分辨率和成像對比度，這也是可見光雙光子激發(v2PE)在超高分辨率顯微鏡中的應用。國內雙光子顯微鏡的成像視野雙光子顯微鏡中，同樣每個時刻只有焦平面上一個點的信號被探測，并且連焦平面外的熒光信號也不會有。

雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主提出，30年后因為有了激光才得到實驗驗證，但是到WinfriedDenk發明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術挑戰和飛秒激光發揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當于和頻產生非線性過程，這要求極高的電場強度，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關，所以關鍵變量只剩下激光脈寬。基于以上分析，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標準激發光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強低無法被激發，所以雙光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可，但是使用很不方便所以遠未實現商用。很快雙光子顯微鏡的標配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態光源優勢，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深，對生物樣品損傷更小。

雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因為有了激光才得到實驗驗證，但是到WinfriedDenk發明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術挑戰和飛秒激光發揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當于和頻產生非線性過程，這要求極高的電場強度，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關，所以關鍵變量只剩下激光脈寬。基于以上分析，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標準激發光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強低無法被激發，所以雙光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可，但是使用很不方便所以遠未實現商用。很快雙光子顯微鏡的標配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態光源優勢，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深，對生物樣品損傷更小。雙光子顯微鏡除了可以進行厚的組織樣品拍攝以外呢，可以在小鼠的的任何部位進行成像。

雙光子顯微鏡是一種先進的成像技術，可以在保持細胞活性的情況下，對深層組織進行高分辨率成像。它主要用于生物學、醫學和材料科學等領域的研究。雙光子顯微鏡的重心技術是基于雙光子激發的熒光成像。當激光通過樣品時，它會吸收特定波長的光子，然后發出熒光。雙光子顯微鏡使用兩個連續的光子同時激發樣品，這樣可以在保持樣品完整性的同時，獲得高質量的圖像。雙光子顯微鏡具有以下優點：1.高分辨率：由于雙光子激發的特性，它可以獲得比傳統顯微鏡更高的分辨率。2.深層成像：由于激光的穿透深度限制，傳統的光學顯微鏡無法對深層組織進行成像。而雙光子顯微鏡可以解決這個問題，因為它可以激發樣品的深層熒光。3.活細胞成像：雙光子顯微鏡可以在保持細胞活性的情況下進行成像，這對于研究細胞生理學和生物化學過程非常有用。4.多模式成像：雙光子顯微鏡可以結合多種技術，如光譜成像、鈣離子成像和神經活動成像等，以提供更豐富的生物樣品信息。總之，雙光子顯微鏡是一種強大的研究工具，可以對深層組織和活細胞進行無損成像。這使得它在生物學、醫學和材料科學等領域的研究中具有廣泛的應用。這種雙光子顯微鏡的視場是普通顯微鏡的10倍。國內激光熒光雙光子顯微鏡的原理

成像平臺倒置雙光子顯微鏡啟用顯微鏡自帶調焦設備。國內激光熒光雙光子顯微鏡授權公司

雙光子顯微鏡(2PM)可以對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器進行亞細胞分辨率的成像，從而測量不透明腦深部的活動。成像膜的電壓變化可以直接反映神經元的活動，但神經元活動的速度對于常規的2PM來說太快了。目前，電壓成像主要由寬視場顯微鏡實現，但其空間分辨率較差，且只能在淺深度成像。因此，為了以高空間分辨率成像不透明腦中膜電壓的變化，需要將成像速率提高2PM。面向模塊輸出端的子脈沖序列可視為從虛擬光源陣列發出的光，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成空間分離和時間延遲的聚焦陣列。然后，該模塊被集成到一個帶有高速數據采集系統的標準雙光子熒光顯微鏡中，如圖2所示。光源是重復頻率為1MHz的920nm激光器。FACED模塊可以產生80個脈沖焦點，脈沖時間間隔為2ns。這些焦點是虛擬源的圖像。虛光源越遠，物鏡處的光束尺寸越大，焦點越小。光束可以沿Y軸比沿X軸更好地填充物鏡，從而在X軸上產生0.82m和0.35m的橫向分辨率。國內激光熒光雙光子顯微鏡授權公司