甲基化分析：DNA甲基化是哺乳動物DNA的一種常見表觀遺傳修飾，它通過調節細胞中的基因表達從而在發育和疾病過程中發揮了重要的作用。異常的DNA甲基化涉及整個基因組的整體低甲基化和位于基因啟動子區域和基因間DNA的CpG島的局部超甲基化，這是人類惡性**中一個常見的表觀遺傳改變。基于PCR的方法已經被***的應用于DNA甲基化的評估，其原理是先采用亞硫酸氫鹽來處理DNA，這會通過脫氨基作用將未甲基化的胞嘧啶轉換為尿嘧啶，然后設計與這些DNA進行特異結合的引物和探針進行擴增檢測。然而，傳統的PCR檢測容易受到PCR抑制劑的影響，在非甲基化等位基因的背景下進行稀有甲基化等位基因檢測的敏感性有限。而數字PCR是在無數個**的分隔之中進行反應，因此彼此之間較少受到抑制劑的影響，能夠對傳統方法檢測不到的罕見甲基化等位基因進行精細的檢測，未來有望將DNA甲基化作為一個具有區域性*變的預測指標或者**風險生物標志物來使用。定量方法不依賴于擴增曲線的循環閾值。四川準確數字PCR活動

雖然數字PCR的優勢與臨床應用前景已在許多研究中得到確認，但想要進一步在臨床廣泛應用，數字PCR需要針對以下幾個方面進行升級：商用數字PCR系統需要進一步提升樣本檢測通量以充分滿足COVID-19普篩的需求；需要制定國家或行業統一標準；需要產業界進一步降低設備成本；基于數字PCR的**檢測試劑盒需要經過嚴格多中心評價，并獲得NMPA、FDA、CE等監管機構的認證。隨著科研和產業的持續研發和投入，未來數字PCR將在實驗室或醫院得到更多的應用，用于解決科研和臨床問題，提供更準確的診斷結果。數字PCR有望成為下一代分子診斷的**技術。四川熒光信號數字PCR方案通過直接計數或泊松分布公式計算得到樣品的原始濃度或含量。

甲基化含量鑒定：傳統的亞硫酸氫鹽處理后的克隆測序法、抗體檢測法、定量PCR檢測法等受限于方法學的問題，不能獲得甲基化程度的精確定量，而數字PCR系統通過對樣品的微液滴處理及目標分子的***拷貝數定量，為甲基化程度的精確定量檢測提供了一種可靠的技術。二代測序輔助建庫：目前靶向測序建庫方法包括擴增子方法，在均相溶液中，當擴增引物增加時，由于擴增引物之間的相互作用，從而影響擴增的效率；如果將其分散到大量微液滴中擴增，將可**降低引物間相互作用，提高擴增效率。同時還可以實現對于少量模板的有效擴增，得到更多的有效測序數據。

為確保實驗順利進行，QIAcuity EG PCR Kit和Probe PCR Kit均采用**抗體修飾的熱啟動DNA聚合酶，利用小分子鎖扣 (Guard molecular) 將DNA聚合酶與抗體緊密結合形成雙保險，使其室溫條件下失活，只有通過95℃高溫2分鐘才能開啟小分子鎖扣，***DNA聚合酶活性，有效避免了非特異性擴增現象。微反應單元體積大小一致且穩定是泊松分布準確計算的前提。樣本反應液在進行液滴分散過程中由于液體表面張力、操作不當等影響，導致其部分發生融合和破裂。融合使液滴體積變大，破裂則導致有效分區數量變少更增加了交叉污染的風險。因此，整個實驗過程需嚴格按照標準流程進行實驗操作。相較于液滴式分區，QIAcuity數字PCR搭配的Nanoplate采用**納米微孔設計，利用微流體技術將數字PCR反應體系分配到大小均一且固定微孔中，并在分區完成后自動封閉所有微孔聯通管道，真正意義上實現**均一的微反應體系。可以用來檢測外泌體micRNA。

數字PCR可以直接計算目標序列的拷貝數，因此無需依賴于對照樣品和標準曲線就可以進行精確的***定量檢測；此外，由于數字PCR在進行結果判讀時*判斷有/無兩種擴增狀態，因此也不需要檢測熒光信號與設定閾值線的交點，完全不依賴于Ct值的鑒定，因此數字PCR的反應受擴增效率的影響**降低，對PCR反應抑制物的耐受能力**提高；數字PCR實驗中標準反應體系分配的過程可以極大程度上降低與目標序列有競爭性作用的背景序列濃度，因此數字PCR技術也特別適合在復雜背景中檢測稀有突變。提高檢測通量，可對多個靶標多個標本并行檢測。熒光信號數字PCR經驗豐富

外泌體里面的micRNA含量是非常低的。四川準確數字PCR活動

數字PCR 的定量方法不依賴于擴增曲線的循環閾值，因此不受擴增效率的影響，也不必采用看家基因和標準曲線，具有很好的準確度和重現性，可以實現***定量分析。在未來十年內，醫學保健的目標是提供質量高效的個性化醫療。PCR 方法會在實現這個目標的過程中發揮重要作用。相比于傳統的PCR，數字PCR 技術有著無可比擬的優勢和***的應用前景。應用領域：突變/稀有變異檢測（Mutation/Rare variant detection）拷貝數變異（Copy-number variation）進入外周循環（包括血液和糞便）的**組織核酸分析無創產前篩查轉化移植檢測藥理學（Pharmacogenetics）基因表達分析（Geneexpression analysis）-特別針對單細胞或少量細胞或者血清血漿樣品線粒體拷貝數分析與線粒體突變分析數字PCR可以驗證二代測序(NGS)。四川準確數字PCR活動