多光子顯微鏡因擁有較深的成像深度，和較高的對比度在生物成像中有著重要的意義，但是它通常需要較高的功率。結合時間上展開的超短脈沖可以實現超快的掃描速度和較深的成像深度，但是其本身所利用的近紅外波段的光會導致分辨率較低。清華大學陳宏偉教授和北京大學席鵬研究員合作研究，結合了結構光成像和上轉化粒子，開發了一種基于多光子上轉化材料和時間編碼結構光顯微鏡的高速超分辨成像系統(MUTE-SIM)。它可以實現50MHz的超高的掃描速度，并突破了衍射極限，實現了超分辨成像。相較于普通的熒光顯微鏡，該顯微鏡提升了，并且只需要較低的激發功率。這種超快、低功率、多光子的超分辨技術，在分辨率高的生物深層組織成像上有著長遠的應用前景。證實了多光子顯微鏡對皮膚和別的皮膚病的診斷的可行性。多光子顯微鏡長時間觀察

通過添加FACED模塊，可以將基于標準振鏡的現有2PM輕松轉換為千赫茲成像系統。FACED雙光子熒光顯微鏡遵循光柵掃描，需要很少的計算處理，在稀疏或密集的標記樣本中均可以使用，并且不受串擾的影響，而且對整個圖像平面采樣后可以進行運動校正。實驗中沒有觀察到光損傷的跡象，此外，子脈沖延遲到達相同的樣品位置，能為熒光團提供充足的時間使其從易于破壞的暗態返回到基態，可以明顯減少光漂白。使用現有的傳感器，FACED雙光子熒光顯微鏡可以提供足夠的速度和靈敏度來檢測神經元過程中的鈣瞬變和谷氨酸瞬變，以及來自細胞體的尖峰和亞閾值電壓。該組使用基于FACED的2PM顯微鏡，在小鼠大腦中實現了千赫茲速率的神經活動成像。在物鏡平均激光功率為10-85mW下，他們測量了清醒小鼠中V1神經元的自發性和感覺誘發性的超閾值和亞閾值電位活動。多光子顯微鏡長時間觀察目前主要使用的多光子顯微鏡包括雙光子顯微鏡和三光子顯微鏡。

世界多光子激光掃描顯微鏡產業主要布局在德國和日本，德國是以徠卡顯微系統和蔡司為，而日本以尼康和奧林巴斯公司為，2020年，上述企業占據著世界多光子激光掃描顯微鏡市場64.44%的市場份額，其發展戰略左右著多光子激光掃描顯微鏡市場的走向。目前世界市場對多光子激光掃描顯微鏡的需求在增長，中國市場這方面的需求增長更快，未來五年多光子激光掃描顯微鏡市場的發展在中國將具有很大的發展潛力。國內顯微鏡制造市場目前斷層嚴重。目前我國顯微鏡行業發展缺乏技術沉淀，20年以上經營積累的企業十分稀缺，深度精密制造、光學重要部件設計及工藝嚴重制約產業升級。目前中國顯微鏡中如多光子顯微鏡、共聚焦掃描和電子顯微鏡等主要集中在徠卡顯微系統、蔡司、尼康、奧林巴斯等國外企業。國內具備生產顯微鏡能力的企業屈指可數，若國內顯微鏡企業能打破技術壁壘，切入顯微鏡市場，企業的生產經營將騰躍至一個更高的格局。

作為一個多學科、知識密集型和資金密集型的高科技產業，多光子顯微鏡涉及醫學、生物學、化學、物理學、電子學、工程學等多個學科。其生產工藝相對復雜，進入門檻較高。它是衡量一個國家制造業和高科技發展水平的重要標準之一。在過去的五年里，多光子顯微鏡的市場是集中的。由于投產成本高，技術難度大，目前涌現的新企業并不多。顯微鏡作為傳統的高科技產業，并沒有被其他技術顛覆，而是一直在不斷融合發展相關技術，在醫療等精密檢測領域發揮更大的作用。顯微鏡的商業化發展已進入成熟階段，主要需求來自教學、生命科學研究和精密測試等。全球市場呈現溫和增長趨勢。而顯微鏡產品(如多光子顯微鏡、電子顯微鏡)正在刺激市場需求，多光子顯微鏡市場發展潛力巨大。多光子共聚焦掃描顯微鏡比雙光子共聚焦掃描顯微鏡具有更高的空間分辨率。

有許多方法可以實現快速光柵掃描，例如使用振鏡進行快速2D掃描，以及將振鏡與可調電動透鏡相結合進行快速3D掃描。而可調電動式鏡頭由于機械慣性的限制，無法在軸向快速切換焦點，影響成像速度?，F在它可以被空間光調制器(SLM)取代。遠程對焦也是實現3D成像的一種手段，如圖2所示。LSU模塊中，掃描振鏡水平掃描，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M，通過調整M的位置實現軸向掃描該技術不僅可以校正主物鏡L2引入的光學像差，還可以進行快速軸向掃描。為了獲得更多的神經元成像，可以通過調整顯微鏡的物鏡設計來放大FOV。然而，大NA和大FOV的物鏡通常很重，不能快速移動以進行快速軸向掃描，因此大FOV系統依賴于遠程聚焦、SLM和可調電動透鏡。多光子顯微鏡是衡量一個國家制造業和高科技發展水平的重要標準之一。清醒動物多光子顯微鏡準確定位

多光子顯微鏡的發展現狀及未來發展趨勢。多光子顯微鏡長時間觀察

與傳統的單光子寬視野熒光顯微鏡相比，多光子顯微鏡具有光學切片和深層成像等功能，這兩個優勢極大地促進了研究者們對于完整大腦深處神經的了解與認識。2019年，JeromeLecoq等人從大腦深處的神經元成像、大量神經元成像、高速神經元成像這三個方面論述了相關的MPM技術。想要將神經元活動與復雜行為聯系起來，通常需要對大腦皮質深層的神經元進行成像，這就要求MPM具有深層成像的能力。激發和發射光會被生物組織高度散射和吸收是限制MPM成像深度的主要因素，雖然可以通過增加激光強度來解決散射問題，但這會帶來其他問題，例如燒壞樣品、離焦和近表面熒光激發。增加MPM成像深度比較好的方法是用更長的波長作為激發光。多光子顯微鏡長時間觀察