WGBS送樣要求一、送樣類型基因組DNA、細胞、全血、動植物組織、FFPE二、保存方式1、基因組DNA、細胞、全血、動植物組織：放-20℃冰箱中保存，或者放-80℃冰箱中長期保存(1年以內)；保存期間避免反復凍融。2、FFPE樣本：室溫保存三、運輸條件1、基因組DNA：冰袋或者干冰運輸；2、細胞、全血、組織樣本：干冰運輸，順豐陸運（3-4天時間），夏季10-15公斤干冰；秋冬季10公斤干冰；3、FFPE樣本：室溫運輸。四、樣本量要求1、基因組DNA：常規WGBS，不少于2ug；微量WGBS，20ng1）提供樣本DNA完整性質檢結果，例如瓊脂糖凝膠電泳或者Agilent2100電泳等；2）提取基因組DNA，要加RNA酶，去除RNA污染；3）提取基因組DNA，溶到TE或者elutionbuffer,避免溶解到純水；樣本體積不超過100ul;4）提供Qubit檢測濃度，基于OD值的檢測方法，例如NanoDrop,會嚴重高估濃度。2、細胞樣本：常規WGBS，不少于5x10*6個細胞；微量WGBS，5000個細胞1）收集貼壁或者懸浮細胞、使用預冷的1×PBS，洗滌2次，600g離心5分鐘；2）***一次離心后，盡量去除上清PBS，保留細胞沉淀;3、全血樣本：2-5ml外周血使用普通EDTA抗凝管，避免使用肝素抗凝管。4、動植物組織：動物組織，30mg以上;植物組織，不同組織。 在哺乳動物中CpG以兩種形式存在。上海ATAC技術服務方案

    Agilent甲基化芯片通過SurePrint芯片合成**技術，結合優化的探針設計及實驗方法，可靈活進行甲基化研究，得到高靈敏度、高特異性、高重復性的結果。技術流程：1.將基因組DNA超聲打斷成400-500bpDN**段；2.加熱變性并將變性后的單鏈DNA樣品分成兩份；3.其中一份單鏈DNA樣品加入抗5'-甲基化胞嘧啶核苷抗體。使用免疫磁珠法分離樣品中甲基化DN**段的抗體復合物，樣品中其余的非甲基化DN**段被洗脫；4.純化免疫共沉淀的DN**段；對MeDIP(Cy5)與Input(Cy3)樣品分別進行標記；5.標記后的MeDIP與Input樣品混合、變性，與芯片雜交；6.檢測雜交信號并進行數據分析。芯片種類：Agilent**甲基化芯片，8x60K●和合作伙伴在Agilent公司定制的Promoter芯片。●絕大多數基因是針對基因啟動子區域的CpG島設計探針。●芯片上一共有4160個功能注釋比較明確的基因，其中2128個和**發生有關系。●從功能上分，有256基因和細胞凋亡有關，1273個基因和信號傳導有關，487個基因和壓力和衰老有關。●特別適用于**甲基化研究。 上海ATAC技術服務方案FFPE樣本只需要室溫運輸。

發育基因的表觀突變是養殖歐洲鱸魚開始馴化的基礎

Epimutations in developmental

genes underlie the onset of domestication in farmed European sea bass. Mol Biol Evol. 2019 May 30 (IF= 14.797)

本研究通過RRBS測序，比較了早期馴化的

(n=12)與野生的(n=12)

歐洲鱸魚在馴化過程中DNA甲基化變化，發現早期馴化的鱸魚與野生的沒有遺傳差異，但在不同胚胎起源的組織中發生DNA甲基化變化。這些甲基化突變與經過25年選擇性育種后的胞嘧啶至胸腺嘧啶多態性***重疊，表觀突變基因與正選擇基因一致。結果表明馴化初始階的表觀變異是一個重要事件。

    全基因組甲基化測序(WholeGenomeBisulfiteSequencing,WGBS)是結合重亞硫酸鹽Bisulfite處理和高通量測序，對有參考基因組進行全基因組的單堿基分辨率的甲基化檢測“金標準”方案，***用于人、哺乳動物及農林牧漁方向的高水平甲基化研究。WGBS滿足全基因組DNA甲基化圖譜及疾病關聯分析、基因調控分析、疾病的甲基化標志物篩選等探索性課題的研究。靈長類早期著床前胚胎發育中的DNA甲基化重編程研究——(團隊成員發表).(IF=)靈長類胚胎發生的關鍵表觀遺傳調控需要DNA甲基化重編程。我們首先建立了基于轉座酶的超微量WGBS測序技術，詳細研究了獼猴早期著床前胚胎7個階段(Sperm、Oocytes、Zygotes、2-cell、8-cell、Morula和ICM)的DNA甲基化動態變化過程。******闡明了DNA甲基化動力學的“盈與虧”階段特征，并通過DNA甲基轉移酶功能缺失實驗表明DNA甲基化影響早期猴胚胎發育。 中小樣本篩選, 大樣本中進一步驗證。

    **預防和***的一個手段是通過去甲基化恢復某些關鍵的抑*基因或DNA修復基因的活性，目前研究**多的是DNMTs***劑，它通過***DNMT活性以逆轉異常的DNA甲基化。**個表型修飾藥物為5-azacytidine及其類似物5-aza-2'-deoxycytidine（5-aza-CdR），這類藥物已經美國FDA批準用于白血病前骨髓增生異常綜合征的***。5-aza-CdR是胞嘧啶的類似物，在DNA復制過程中可以摻入到DNA鏈中，一方面它可以降低DNA接收甲基的能力，另一方面它***DNMT活性，導致DNA甲基化水平的降低。體外和體內試驗均表明，5-aza-CdR具有降低超甲基化的抑*基因甲基化水平從而*****的能力，臨床表明應用5-aza-CdR可提高部分IV期小細胞肺*患者生存率，但該藥也存在著不可忽視的毒副作用（如特異性不強，不能針對某一特定抑*基因進行靶向***；高劑量的5-aza-CdR可能誘發**的轉移），因此其在臨床上的應用受到了很大限制。也有研究表明，低劑量的As2O3可起到***肝*的目的。 RRBS用于人、哺乳動物及魚類方向的高水平甲基化研究。上海ATAC技術服務方案

RRBS開發的初衷就是為人和哺乳動物，提供全基因組范圍的、高性價比的甲基化檢測金標準方案。上海ATAC技術服務方案

    羥甲基化DNA免疫沉淀測序（HydroxymethylatedDNAImmunoprecipitationSequencing，hMeDIP-Seq）是通過5hmC特異性抗體富集羥甲基化的DN**段，然后結合高通量測序技術在全基因組水平上以較小的數據量，快速、高效地尋找羥甲基化區域。可廣泛應用于羥甲基化與疾病關系研究以及羥甲基化在胚胎發育過程中的研究。技術優勢從項目背景了解、協助方案設計、實驗材料選取、建庫測序，到數據分析每個項目有特定的科學問題；需要專業、有價值的建議；科學、縝密的設計及時高效的溝通；以保障高質量研究成果樣本要求：基因組DNA:>=3ug；樣品濃度>50ng/ul；無RNA和蛋白污染建庫測序：測序策略：IlluminaHiSeq,PE150;測序深度：20-30Mreads信息分析基于全基因組范圍的羥甲基化分析，數據質控，Peak鋒Calling，Peak鋒在基因組、染色體、功能元件上的分布，多樣本羥甲基化差異聚類，差異羥甲基化DMR鑒定及相關基因的功能分析，結合項目背景和科學問題的數據亮點挖掘。 上海ATAC技術服務方案